ДНК-вакцина (также генная вакцина, вакцина на основе нуклеиновых кислот) — генно-инженерная конструкция, которая после введения в клетку обеспечивает выработку белков патогенов или опухолевых антигенов и вызывает иммунную реакцию. Введение ДНК-вакцин в организм называют генетической иммунизацией. ДНК-вакцинация имеет ряд преимуществ по сравнению с обычными вакцинами. В частности показано, что такие вакцины обеспечивают не только выработки антител (гуморальный иммунитет), но и специфическую цитотоксическую ответ (клеточный иммунитет), ранее было достижимым только с помощью живых вакцин. Сегодня ДНК-вакцины не применяют для лечения человека, однако прогнозируется, что генетическая иммунизация поможет преодолеть целый ряд заболеваний.

История создания

Идея использовать фрагменты ДНК для вакцинации появилась в 50-60-е годы. После серии опытов было выяснено, что генетическая информация ДНК сохраняет способность транскрибироваться и транслироваться после переноса в другую клетку. В том же году обнаружили, введение животным генома вируса полиомиелита стимулирует выработку антител. Позже активацию гуморального иммунитета показали для молекул ДНК, полученных из неинфекционных агентов. Начиная с 90-х годов научные лаборатории начали все активнее исследовать иммуностимулирующие свойства ДНК. В 1992 году Танг вместе с коллегами показал, что ген гормона роста человека, встроенный в плазмиду, стабильно экспрессируется в организме мыши, а синтезированный гормон распознается иммунной системой как антиген и стимулирует выработку антител. Процесс ввода плазмидной ДНК для стимуляции гуморального иммунитета был назван Танго »генетическая иммунизация». Однако уже в следующем году другая группа ученых заявила, что введение плазмиды, кодирующей белки вируса гриппа, вызывает как гуморальный, так и клеточный ответ. Индукции обеих ветвей иммунитета того же года обнаружили и для плазмиды, содержащей гены ВИЧ. С 1995 года начали появляться данные, что ДНК-вакцинация способна активировать иммунную систему против раковых заболеваний. Около 20 лет назад состоялись первые клинические испытания ДНК-вакцин, которые в первую очередь должны были продемонстрировать безопасность нового метода. Пациентам вводили гены ВИЧ, вируса гриппа, герпеса, гепатита B, возбудителя малярии. Результаты всех тестов оказались вполне обнадеживающими: ДНК-вакцины стабильно експресувались, провоцировали иммунный ответ и не вызывали серьезных побочных эффектов, что послужило толчком для их дальнейшего исследования.

Конструирование ДНК-вакцины

По структуре ДНК-вакцина — это встроенная в вектор нуклеотидная последовательность, кодирующего определенный антиген или антигены. Вектором в генной инженерии называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая служит для доставки генетического материала в клетки и обеспечивает его репликацию или экспрессию. Ранее для транспортировки генов в клетку применяли векторы на основе вирусов: модифицированного (ослабленного) вируса натуральной оспы, аденовирусов и ретровирусов. Вирусные векторы являются достаточно эффективными, однако имеют значительную вероятность развития побочных эффектов, связанную с относительно высокой иммуногенностью самого вектора. Поэтому на сегодня в качестве вектора чаще используют бактериальную плазмиду — небольшую стабильную кольцевую молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Сама по себе плазмида не вызывает нужной специфического иммунного ответа, для этого у нее вшивают гены иммуногенных белков. Также ДНК-вакцина должна содержать регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии генов в клетках эукариот. Готовую ДНК-конструкцию доставляют в бактериальную клетку, где наращивается количество ее копий. После этого проводят выделения и очистки плазмид, которые несут нужную вставку.

Дизайн плазмидного вектора

Важным этапом создания ДНК-вакцин является дизайн (конструирование) вектора. Обязательными структурами плазмидного вектора есть сайты рестрикции, селективный маркер и точка начала репликации ДНК-вакцины в бактериальной клетке. Чтобы осуществлялся синтез антигена, ДНК-вакцина должна содержать промотор и сигнал полиаденилирования. Промотор является важным фактором эффективности вакцины, поскольку определяет силу иммунного ответа: чем больше экспрессия гена, кодирующего вирусный или опухолевый антиген, тем сильнее иммунный ответ. Чаще всего используют промотор вируса SV40 или цитомегаловируса (CMV). Для стабилизации мРНК-транскриптов в плазмиду встраивают сигнал полиаденилирования, чаще всего, полученный из гена гормона роста быка (BGH) или вируса SV40. В качестве селективных маркеров выбирают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, часто это ген устойчивости к канамицину. При конструировании ДНК-вакцин наиболее популярна точка начала репликации Escherichia coli.

Выбор гена для иммунизации

Вектор является важным компонентом ДНК-вакцины, однако ее иммуногенность определяется именно вставкой — последовательностью ДНК, кодирующей антиген. Среди вирусных антигенов для иммунизации лучше всего подходят белки слияния — это относительно консервативные белки, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку. Для вакцинации против грамположительных бактерий в плазмидный вектор целесообразно встраивать гены тех бактериальных белков, которые определяют патогенез заболевания. Среди белков грамотрицательных бактерий высокую имунногенисть имеют погрузится. Для терапевтических противоопухолевых ДНК-вакцин используют белки-маркеры раковых клеток.

Способы доставки ДНК-вакцин в клетку

Готовую вакцину нужно доставить в организм человека или животного, где ее точка назначения — антиген-презентуя клетки (АПК) — макрофаги, дендритные клетки, В-лимфоциты. Здесь будет происходить синтез и посттрансляционной модификации антигенной, после чего он будет встроен в мембрану клетки, чтобы привлечь внимание иммунной системы. Основа проблема заключается в доставке достаточного количества плазмиды в АПК. Методы доставки генетического материала в клеточную разделяют обычно на 2 группы: вирусные и невирусные. Поскольку вирусные векторы имеют ряд существенных недостатков, в данном разделе представлены только невирусные методы доставки ДНК-вакцин.

Микроинъекция

В начале 1990-х для ввода ДНК в клетку наиболее распространенным были внутримышечные микроинъекции, что обусловлено простотой метода. Для этого ДНК растворяют в воде или изотоническом растворе, при необходимости добавляют адъювант (вещество, усиливающее иммунный ответ). Далее с помощью тонкой стеклянной трубки раствор вводят в мышечную ткань, где роль АПК выполняют дендритные клетки. Попав в ядро ​​дендритной клетки вакцина начинает экспрессироваться и происходит синтез белков-антигенов. С помощью микроинъекций ДНК можно вводить подкожно, в тимус, печень, опухолевую ткань, однако именно в мышечной ткани наблюдается наиболее длительная (до года) экспрессия ДНК-вакцины. Благодаря высокой концентрации клеток Лангерганса (подтип дендритных клеток), привлекательной мишенью для ДНК-вакцинации является кожа. Для интрадермального (подкожного) введения используют массив с микроигл, длина которых несколько сотен микрон. Существуют различные варианты интрадермальном вакцинации. Проще включая разрыхления массивом микроигл рогового слоя кожи (внешний слой кожи, обычно 10-20 мкм), чтобы увеличить ее проницаемость для дальнейшего местного введения раствора ДНК. Более эффективным является использование микроигл, покрытых сухой вакциной, которая растворяется уже под кожей. Эффективность этого метода обычно низкая, поскольку сначала ДНК попадает в межклеточное пространство, а уже потом включается в клетки.

Электропорация

Электропорация — традиционный подход для доставки ДНК в бактериальные клетки и культуры клеток, основанный на применении электрического импульса. Такой импульс создает поры в клеточной мембране, что способствует вхождению отрицательно заряженной ДНК. Этот способ был заимствован для доставки ДНК-вакцины в организм животных и человека и позволяет значительно повысить эффективность обычной инъекции. Прибор для электропорации содержит источник электрического тока и одноразовую сетку, которая состоит из шприца и игл-электродов. Шприц вводит вакцину в мышечную ткань, а электроды создают электрическое поле, которое облегчает вхождение ДНК в миоциты и дендритные клетки. На сегодня разработаны устройства, которые позволяют повысить эффективность вакцинации в 1000 раз по сравнению с обычной инъекцией. Электропорации можно применять как для внутримышечного, так и для подкожного введения ДНК-вакцины. Недостатками являются незначительная болезненность в месте инъекции, потребность в специализированных устройствах. Вместо электрического поля можно использовать магнитное. Такие устройства действуют по тому же принципу, однако в этом случае процедура полностью безболезненной и менее повреждает клетки.

Действие электрического поля не только усиливает поглощение ДНК-вакцины клетками, но и стимулирует выработку иммунного ответа. Применение электропорации приводит к незначительному повреждению ткани — развивается локальный воспалительный процесс. Повреждении клетки выделяют хемокины, поэтому к ним направляются макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Увеличение концентрации иммунных клеток в месте введения вакцины повышает ее эффективность.

Сонопорация

Сонопорация — метод переноса чужеродной ДНК в клетки с помощью ультразвука. Ультразвук увеличивает проницаемость клеточной мембраны, вследствие чего экзогенная ДНК легче проникает в клетку. Впервые сонопорация для переноса генов в клетку была применена в 1986 году. Этот метод применяется для ввода молекул ДНК в клетки роговицы, мозга, костной ткани, почек, поджелудочной железы, эмбриональной ткани, скелетных и сердечной мышц. Относительно других методов сонопорация является малоисследованной, необходимо еще немало усилий, чтобы повысить ее эффективность, особенно на уровне целого организма.

Баллистическая трансфекция

Баллистическая трансфекция основывается на обстреливания (бомбардировке) органов и тканей микрочастицами тяжелых металлов (золото, вольфрам) диаметром 1-3 мкм покрытых молекулами ДНК. Введена таким образом ДНК-вакцина экспрессируется в клетках-мишенях, а их продукты попадают в кровь. Для предоставления ускорение частицам используются похож на стрелковое оружие устройство — генный пистолет или генную пушку. Микрочастицы проходят через клеточные мембраны и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядро ​​клетки. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика — до 1 мм, поэтому метод применяют преимущественно для трансфекции кожи или прилегающей хрящевой ткани. Особые условия обстрела позволяют микрочастицам проникать на глубину до 4-5 мм и переносить генные конструкции в волокна поперечно-полосатых мышц. Обычно клетки, находящиеся непосредственно по центру выстрела, погибают, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформовани клетки. Эту технологию называют также биобалистикою или биолистикою.

Первый генный пистолет был создан группой ученых в период 1 983 и 1 986 годами с целью трансформации клеток растений. Это был пистолет, разработанный на основе устройства, для автоматического забивания гвоздей. На вольфрамовую шар наносили ДНК с репортерного (маркерным) геном и выстреливали ней в чашку Петри. Экспрессия репортерного гена свидетельствовала об эффективности иммунизации. На сегодня для доставки ДНК используют частицы из золота или серебра, так как они являются не токсичен для клетки, в отличие от вольфрамовых.

Под действием высокого давления

В 1999 году были разработаны инъекционные приборы, которые способны вводить ДНК-вакцину без использования иглы. Такие устройства работают благодаря силе Лоренца: небольшой мощный магнит создает значительное давление, проводит в действие поршень, который выбрасывает лекарственный препарат со скоростью звука. Изменяя силу тока можно выбирать глубину инъекции и дозировать лекарства. Процедура совершенно безболезненна и раньше использовалась для введения инсулина больным диабетом и при проведении масштабных вакцинаций. Существенным недостатком этого метода является то, что высокое давление теоретически может изменять структуру молекул, которые вводятся. Тем не менее, данную технологию введения продолжают совершенствовать, и на сегодня разработаны приборы, которые могут доставить ДНК на глубину до 16 мм.

В составе живого бактериального вектора

Живые бактериальные векторы — это штаммы Salmonela, Shigella или Listeria, которые несут мутацию в генах биосинтеза или инвазии, что устранение патогенность и способность сохранять свою жизнеспособность в организме хозяина или окружающей среде. Зато в геном бактерий встраивают нужные гены иммуногенных протеинов. Ослабленная бактерия вводится в организм пероральным путем (через рот, путем проглатывания) или интроназально (путем впрыскивания в носовое отверстие), поэтому этот способ вакцинации не требует ни оборудования. Кроме того, такое введение стимулирует иммунный ответ слизистой оболочки, важно, поскольку большинство патогенов попадают в организм через ротовое и назальный отверстия. Минуя желудок ослаблена бактерия попадает в тонкий кишечник. Далее бактерия проникает в Пеер бляшки — лимфоузлы кишечника. Оказавшись в середине пейеровы бляшек, бактерии становятся мишенью для макрофагов и подвергаются фагоцитозу. В цитоплазме макрофага происходит высвобождение бактерией ДНК-вакцины, после чего ДНК попадает в ядро, а бактерия обезвреживается иммунной системой.

Упаковка в липосомы

Липосома — шаровидные образования (около 100 нм в диаметре), состоящий из двойного липидного слоя. Липосомы полые внутри, которая обычно заполнена растворителем, но может использоваться для доставки различных веществ, в том числе и ДНК-вакцин. Их гидрофобный оболочка позволяет им сливаться с клеточными мембранами и переносить свое содержимое внутрь клетки. Использование липосом началось в 1965 г.., И это стало мощным двигателем развития бионанотехнологий.

Перспективным способом прямого ввода ДНК конструкции в клетки-мишени является доставка генетической конструкции в составе катионных липосом, построенных из положительно заряженных липидов. Катионные липосомы с отрицательно заряженной молекулой ДНК образуют ДНК-липидный комплекс — липоплекс. Преимущества применения таких комплексов — способность нести большой объем информации, неинфекцийнисть, кроме того, они просты и недороги в изготовлении. В 2003 были созданы чрезвычайно малы — милимикронни липосомы покрыты полимером полиэтиленгликолем, которые способны проносить терапевтическую ДНК через гематоэнцефалический барьер и доставлять ее в нейроны головного мозга, до этого было невозможным.

В составе полиплекс

Для введения в клетку ДНК-конструкций больших размеров (> 10 т.п.н.) используют полиплекс — системы, состоящие из положительно заряженных полимеров (поликатионив) и отрицательно заряженных молекул ДНК. Размер таких комплексов составляет менее 100 нм, что, с одной стороны, чем подвергает их на переваривание макрофагами (так они реагируют на частицы более 200 нм), а с другой стороны, они достаточно большие, чтобы не фильтроваться в почках.

Поликатионы конденсированных молекулу ДНК в комплексы, таким образом обеспечивают ее стабильность и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связывающий полимеров могут служить катионные белки, синтетические гомополимера аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиетиленамин. Обычно в составе полиплекс поликатион находится в избытке, в результате чего данный комплекс является растворимым и положительно заряженным. Если к полиплекс пришить лиганд к определенному клеточного рецептора, то ДНК-вакцину можно направлять в конкретный тип клеток. Процесс доставки генетического материала в составе полиплекс включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения к клеткам-мишеням) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишеней, эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Первым барьером, который необходимо преодолеть комплекса, является кровь и внеклеточный матрикс. Поэтому подбираются такие физико-химические параметры полиплекс, чтобы увеличить его стабильность, избежать нежелательных взаимодействий с белками крови и иммунной реакции, вызванной химической природе поликатиону. Попав в клетки-мишени, полиплекс абсорбируется на плазматической мембране, поглощается путем эндоцитоза, после чего он должен покинуть эндосом и диссоциировать на катионный полимер и молекулу ДНК. Свободная ДНК направляется в ядро, а катионы полимер покидает клетку и выводится из организма.

Характеристика наиболее распространенных методов доставки ДНК-вакцин
Метод	Преимущества	Недостатки
Внутримышечные или подкожные инъекции	Не требуется специального оборудования Постоянная или долговременная экспрессия ДНК разносится по прилегающим тканям	Низкая эффективность Нужна относительно большое количество ДНК
Электропорация	Высокая эффективность	Повреждение тканей
Генный пистолет	Высокая точность Требуется небольшое количество ДНК	Требует наличия инертных микрочастиц Повреждение клеток в месте выстрела
Введение за счет высокого давления	Относительно простой метод Отсутствует потребность в микрочастицах ДНК может проникать на глубину от нескольких мм до 1,5 см	Влияет на структуру ДНК Низкая эффективность иммунизации Требует большого количества ДНК (до 300 мкг)
Упаковка в липосомы	Высокая эффективность in vitro Простота изготовления Большая емкость Можно сочетать с другими методами При внутривенном введении вакцина потенциально может попадать во все ткани Интроназальне введение обеспечивает экспрессию вакцины в слизистой оболочке носа и выработки иммуноглобулинов класса А (IgA)	Возможна токсичность Низкая эффективность in vivo

Механизм развития иммунного ответа

Синтезированный в клетке антиген подвергается процессингу, после чего происходит его презентация иммунокомпетентных клеток. Процессинг — это расщепление антигенного протеина на иммуногенные пептидные фрагменты. Презентация означает подачу фрагмента антигена соединенного с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) иммунокомпетентных клеток. Различают два наиболее значимых класса этих молекул: МНС класса I (МНС-I) и МНС класса II (МНС-II). Для связывания с молекулами каждого класса антиген проходит подготовку в специализированных компартментах клетки. Эндогенные белки-антигены направляются на деградацию в протеасому, после чего представляются в комплексе с МНС-I на поверхности клетки. Здесь при встрече их распознают CD8 + T-клетки (Т-киллеры), которые реализуют цитотоксическое иммунный ответ. Экзогенные белки расщепляются лизомнимы протеазами, включаются в состав MHC-II и распознаются рецепторамиCD4 + Т-клеток (Т-хелперов). Последние вызывают как клеточную, так и гуморальный ответ.

Презентация антигена по пути МНС-I

ДНК-вакцинация предусматривает эндогенный синтез антигена, поэтому этот путь является преобладающим. Процессинг антигена по пути МНС-I проходит в несколько этапов. Синтезирован в ядре белок транспортируется в цитоплазму, расщепляется Протеасома на короткие пептиды — эпитопы, которые специальными белками-транспортерами антигенов (ТАР, transporter associated with antigen processing) переносятся в эндоплазматический ретикулум (ЭПР). В ЭПР каждый эпитоп сочетается с молекулой MHC-I, после чего образованный комплекс направляется в аппарат Гольджи (АГ) на гликозилирования. Оттуда комплекс в составе везикулы стремится к плазматической мембраны. После слияния везикулы с плазмалемме комплекс оказывается на поверхности клетки, где распознается рецепторами Т-киллеров, которые обладают цитотоксической активностью.

Презентация антигена по пути МНС-II

Основным источником пептидов, связываются с МЧС-II являются экзогенные белки, которые попали в клетку с помощью эндоцитоза. Однако показано, что некоторые внутриклеточные белки также могут быть представлены в комплексе с МЧС-II. При этом новосинтезированные белки после попадания в цитоплазму переносятся в лизосомы, где антиген расщепляется под действием кислых протеаз. После этого лизосома, содержащий эпитопы, сливается с везикулой, которая несет молекулу МЧС-II. Внутри объединенной везикулы образуется комплекс эпитоп-МЧС-II, после слияния везикулы с плазмалемме выносится на поверхность клетки. Здесь этот комплекс распознается рецепторами Т-хелперов, в результате чего происходит их активация. Это приводит к стимуляции как клеточного (активация Т-киллеров), так и гуморального иммунитета (активация В-лимфоцитов).

Традиционная вакцинация растворимыми белковыми антигенами нацелена на мобилизацию T-хелперов. Сравнительно низкая ответ Т-хелперов является одним из недостатков ДНК-вакцин. Также нынешнее поколение ДНК-вакцин не способно индуцировать продукцию высоких титров антител. Чтобы повысить активацию Т-хелперов, антиген нужно перенаправить на путь МЧС-II. Для этого в ДНК-вакцину встраивают сигнал лизосомной локализации синтезированный антиген будет направляться в лизосомы, а значит ступать на путь МЧС-II

Стратегии повышения эффективности ДНК-вакцины

Главный вопрос относительно будущего ДНК-вакцин касается повышения их эффективности. В настоящее время проводится большое количество исследований, посвященных оптимизации разработанных ДНК-вакцин. Поиск решения ведется в двух направлениях: повышение экспрессии вакцины и увеличение иммуногенности закодированного антигена.

Оптимизация транскрипционных элементов

Важным компонентом ДНК-вакцины промотор. Бактериальные промоторы не подходят для экспрессии антигенной в клетках млекопитающих, поэтому вместо них использовали промоторы онкогенных вирусов. Сейчас для повышения безопасности вакцин их заменили на промоторы от неканцерогенных объектов, например, человеческого цитомегаловируса (CMV). Для большинства ДНК-вакцин этот промотор является оптимальным выбором: он характеризуется высокой экспрессией в широком диапазоне клеток. Для экспрессии гена в конкретных тканях, перспективным является использование промоторов, специфических для этого типа тканей. Например, использование промотора мышечной КФК при м введении приводит к десятикратного увеличения синтеза антител и индукции Т-клеточного ответа, чем использование аналогичной ДНК-вакцины с CMV промотором. Также высокую эффективность в миоцитах показал промотор гена десмина, кодирующего один из белков цитоскелета. Для повышения экспрессии ДНК-вакцины в кератиноцитах (клетки эпителиальной ткани) используют промоторы гена металотионеину (белок, связывающий тяжелые металлы) или гена гидроксилазы витамина D 3.

Уровень инициации транскрипции, как правило, повышается за счет использования мощного промотора и энхансер, а особенности терминации могут стать ограничивающим фактором. Эффективность полиаденилирования и процессинга первичного РНК-транскрипта меняется в зависимости от последовательности polyA-сигнала. То есть, последовательность полиаденилирование влияет на синтез антигена. Например, широко используемый polyA-сигнал вируса SV40 имеет меньшую эффективность чем сигнал полиаденилирования гена β-глобина кролика или гена гормона роста быка.

Для эффективной трансляции мРНК млекопитающих должна так называемую последовательность Козак. Вставка этой последовательности в ДНК-конструкцию может существенно увеличивать уровень синтеза антигена. Чтобы РНК-полимераза НЕ проскочила стоп-кодон гена и не состоялся синтез удлиненного протеина, который не сможет потом приобрести правильной укладки, ген можно заканчивать двойным стоп-рубежом.

При конструировании ДНК-вакцины также пытаются оптимизировать ее кодоны. Процедура оптимизации означает замену кодонов в последовательности гена таким образом, чтобы аминокислотная последовательность белка без изменений, но увеличивалась эффективность трансляции его мРНК. Причиной является то, что большинство аминокислот кодируются более чем одним рубежом. Каждый кодон имеет свою тРНК и представленность различных тРНК в клетке неодинакова, причем она также варьирует в зависимости от вида организма. Кодоны подбирают таким образом, чтобы наличие нужной тРНК при синтезе антигена не стала лимитирующим фактором.

Оптимизация антигена

Хотя сила иммунного ответа коррелирует с уровнем экспрессии ДНК-вакцины, однако для каждого антигена существует определенное плато, после которого увеличение количества антигенного протеина повышать продукцию антител. В то же время, достичь более сильной иммунной реакции можно за счет оптимизации антигена. Например, путем объединения антигена с лигандом к определенному рецептора антиген-презентуя клетки. Таким лигандом может быть маркерный белок CD40, внеклеточный домен Fms-образной тирозинкиназы-3 или антиген-4 Т-киллеров. За счет взаимодействия лиганд-рецептор повышается эффективность захвата антигенного протеина АПК.

Облегчение деградации антигена в Протеасома или лизосома также стимулировать иммунную реакцию. Для усиления протелиотичного расщепления антигена, в его последовательность встраивают сигнал убиквитинування Ошибка цитирования: Неправильный вызов: тег ref без названия должен иметь входные данные. Использование ДНК-вакцин, кодирующие вместо целого антигена, несколько эпитопов различного происхождения, позволяет значительно расширить спектр иммунного ответа.

Для противоопухолевых ДНК-вакцин эффективна комбинация «опухолевый антиген + вирусный или бактериальный антиген». Например, сочетание опухолевого антигена с эпитопом токсина столбняка значительно повышает активацию Т-киллеров против раковых клеток.

Включение адъювантов

При применении традиционных вакцин для повышения иммунного ответа к ним добавляют адъюванты. ДНК-вакцина имеет бактериальное происхождение, поэтому она сама является иммуностимулятором. Для усиления иммунного ответа в ДНК-вакцину встраивают гены адъюванта или применяют дополнительную плазмиду, которая кодирует иммуностимулирующие белки.

Иммуностимулирующее действие бактериальных CpG динуклеотидов

Функция плазмиды не ограничивается доставкой генов в клетки. Еще в 1893 году было обнаружено, что смесь бактериальных лизатов уменьшает прогрессирование раковых опухолей, однако только в 1983 установили, что иммуностимулирующие свойства лизата обусловленные молекулами ДНК бактерии. В 1995 году показали, что стимуляция иммунитета вызвана CpG-мотивами бактериальной ДНК. У бактерий, а также ДНК-вирусов, эти мотивы являются неметилованимы. В организме человека и высших приматов, наоборот, цитозин в составе большинства CpG-динуклеотидов содержит метильную группу. Поэтому неметиловани CpG-мотивы воспринимаются человеческим организмом как патагенасоцийовани молекулярные паттерны (PAMP, pathogen-associated molecular patterns). Рамри-соединения распознаются Toll-подобными рецепторами, которые в зависимости от типа лиганда, разделяют на несколько типов. Неметиловани CpG-мотивы распознает рецептор TLR-9, расположенный на мембранах эндоплазматического ретикулума В-лимфоцитов, дендритных клеток и натуральных киллеров. Связывание рецептора с неметилованимы CpG-мотивами запускает каскад реакций, в результате которого индуцируется синтез провоспалительных цитокинов — интерферона-1 и IL-12.

Экспрессия цитокинов и других иммуномодуляторов

Для ДНК-вакцинации в качестве адъювантов чаще всего применяют гены цитокинов. Цитокины — это класс белковых молекул, регулирующих межклеточные и межсистемные взаимодействия в организме, в частности, функционирование иммунной системы. Все цитокины, а их известно более 30 могут модулировать иммунный ответ. Цитокины IL2, IL-12, интерферон γ, IL-15, IL-18 и IL-23 оказывают стимулирующее влияние на Т-хелперы первого класса. К цитокинов, модулируют действие Т-хелперов второго класса, относятся: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 I IL-13. Тип цитокина подбирают согласно того, какой тип иммунного ответа хотят усилить.

Добиться повышения иммунного ответа можно с помощью хемокинов. Хемокины — это семейство цитокинов, которые способны вызвать хемотаксис чувствительных к ним клеток, в том числе и иммунных. В частности, рецепторы к хемокинов является на антигенперезентуючих клетках хемокинов. Связывание Хемокиновые со своим рецептором приводит к эндоцитоза комплекса антиген-хемокин внутрь АПК. Эта стратегия эффективно используется как при разработке противовирусных ДНК-вакцин, так и противоопухолевых.

Функцию адъюванта также может выполнять белок HSP70 (heat-shock proteins, белки теплового шока). Иммуностимулирующее действие HSP70 основано на его способности выходить во внеклеточное пространство и связываться с рецепторами АПК. Механизм транспорта HSP70 наружу пока окончательно не выяснен, но скорее всего существует несколько путей — экзоцитоз, секреция наружу или выход через канал. Связывание HSP70 со своим рецептором приводит к активации дендритных клеток, опосредует презентацию антигена и стимулирует продукцию хемокинов. Поскольку антиген слит с HSP70, он также попадает во внеклеточное пространство, поэтому может презентоваться по пути МЧС-II и активировать В-клетки. Во избежание аутоиммунных реакций для ДНК-вакцин используют бактериальный ген HSP70.

Преимущества и недостатки ДНК-вакцин

Метод ДНК-вакцинации обладает рядом преимуществ, наиболее важной из которых является запуск как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. Вакцины на основе ДНК обеспечивают долговременную экспрессию антигена и, соответственно, устойчивую иммунный ответ. К дополнительным факторам, способствующим развитию ДНК-иммунизации, относят простоту и низкую стоимость производства вакцины.

Преимущества

Недостатки

Антиген приобретает нативной конформации Активация обеих ветвей иммунитета: гуморального и клеточного Синтезированный антиген можно избирательно направлять на путь МЧС-I или МЧС-II Могут избирательно действовать на разные популяции Т-хелперов Обеспечивают долговременную экспрессию антигена Простые и быстрые в изготовлении Низкая цена производства Не требуют особых условий хранения Могут применяться как для профилактики, так и для лечения болезней Потенциально эффективными против широкого спектра болезней: бактериальным, вирусным, аутоиммунных и раковых заболеваний

Слабая иммуногенность Для вирусных векторов существует опасность интеграции чужеродной ДНК в геном клетки Возможно развитие аутоиммунных реакций Плазмидные и вирусные векторы могут вызвать неспецифическую иммунный ответ

Применение ДНК-вакцин

Первые клинические исследования ДНК-вакцин, вместе безопасностью нового метода, продемонстрировали его низкую эффективность. Понимая перспективность ДНК-иммунизации, научные лаборатории вместе с биотехнологическими компаниями направили свои усилия на оптимизацию нового метода, и уже через несколько лет удалось добиться значительного прогресса. В 2005 году первая ДНК-вакцина получила разрешение FDA (англ. Food and Drug Administration) для применения на животных. По состоянию на 2013 г.. Больше ста ДНК-вакцин проходят клинические испытания и четыре ДНК-вакцины лицензированы для использования в животноводстве.

ДНК-вакцины в ветеринарии

Все четыре одобрены FDA вакцины созданы на основе плазмид. Для трех из них рекомендован производителем способ введения — внутримышечно, для вакцины LifeTide® — инъекция, соединенная с электропорации. Если остальные вакцин направлена ​​на активацию иммунитета, то для вакцины LifeTide® иммуностимулирующее действие является дополнительной. Продукт вакцины — Соматолиберин, гормон стимулирующий высвобождение гипофизом гормона роста и пролактина. Действие последних двух гормонов у свиней приводит к росту массы животных и увеличение количества выводке. Вместе с тем, введение животным плазмиды, кодирующей Соматолиберин, стимулирует выработку Т-лимфоцитов, натуральных киллеров, следовательно увеличивает иммунный сопротивление организма.

Торговое название вакцины	Год лицензирования	Мишень	Животное	Продукт вакцины	Цель создания вакцины
West Nile-Innovator® (США)	2005	Вирус лихорадки Западного Нила	Лошади	Структурный белок вируса PreM-E	Защита против вируса
Apex-IHN® (Канада)	2005	Возбудитель инфекционного некроза гемопоэтической ткани	Рыбы семьи Лососевые	Вирусный гликопротеин	Повышение количества и качества продовольствия рыбы
LifeTide® SW 5 (Австралия)	2008	Гормон роста	Свиньи и другая домашний скот	Соматолиберин свиньи	Увеличение выводке у свиноматок; значительно снижает снижение перинатальной смертности и заболеваемости
ONCEPT® (США)	2010	Меланома	Собаки	Тирозиназы человека	Как альтернатива лучевой терапии и операционном вмешательству при лечении меланомы

Перспективы ДНК-вакцинации

Противоопухолевые ДНК-вакцины

В то время как индукция клеточного и гуморального иммунного ответа убедительно продемонстрирована для чужеродных антигенов, ассоциированных с инфекционными заболеваниями, применение ДНК-вакцин для лечения рака до сих пор было менее успешным. Индукция эффективного противоопухолевого иммунитета является сложной задачей. Клинические исследования подтвердили общую безопасность и низкую токсичность противоопухолевых ДНК-вакцин, однако эффективность вызванной ими иммунного ответа оказалась слабой, а противоопухолевая активность, в некоторых случаях, вообще сомнительна.

ДНК-вакцины против вирусных и бактериальных возбудителей

ДНК-вакцина против кариеса

Причиной кариеса является локальное изменение pH в результате брожения (гликолиза) углеводов, осуществляемого бактериями. Учеными из Уханська Института вирусологии (Китай) была разработана ДНК-вакцина направлена ​​против одного из возбудителей кариеса — Streptococcus mutans. Вакцина построена на основе плазмиды и кодирует два белка: поверхностный протеин St. mutans PAc и флагелин, полученный из бактерии Salmonella, который выполняет роль адъюванта. На стадии доклинических исследований вакцину через нос вводили лабораторным грызунам, после чего у животных проверяли уровень иммуноглобулинов G в сыворотке крови и секреторных иммуноглобулинов А в слюне. После проведенных исследований ученые выяснили, что уровень иммунных белков и в крови, и в слюне повышался, но, что важнее, при этом тормозился рост колоний Streptococcus mutans на зубной эмали. То есть, зубы вакцинированных животных были лучше защищены от кариеса.

ДНК-вакцины и лечения аутоиммунных заболеваний

ДНК-вакцина против диабета 1 типа

Сахарный диабет типа 1 характеризуется потерей инсулин-продуцирующих бета-клеток, расположенных в островках Лангерганса поджелудочной железы. Главная причина потери бета-клеток — аутоиммунное поражение Т-киллерами. Для того, чтобы защитить бета-клетки от гиперактивного функции иммунной системы, ученые из Стэнфордского (США) и Лейденского (Нидерланды) университетов, разработали ДНК-вакцину BHT-3021. Вакцина создана на основе плазмиды и кодирует предшественник инсулина — проинсулин. Это вакцина обратной силы: если обычные вакцины должны активировать иммунные реакции, то BHT-3021, наоборот, нейтрализует цитотоксическое действие Т-киллеров направленную против островков Лангерганса.

В первой фазе клинических испытаний BHT-3021 показала свою эффективность на группе 80 человек. Половина из них каждые семь дней в течение 12 недель получала внутримышечные инъекции BHT-3021, а вторая половина — плацебо. По истечении этого срока группа, которая получала вакцину, продемонстрировала повышение уровня С-пептидов в крови, что свидетельствует о восстановлении функции бета-клеток. Никаких серьезных побочных эффектов у одного из участников зафиксировано не было. Действие вакцины сохранялась в течение 2 месяцев.

Введение

1 Основные группы ферментов генетической инженерии

1.1 Рестриктазы

1.1.1 Механизм действия рестриктаз

1.1.2 Построение рестрикционных карт

1.3 Лигазы

2 Введение нового гена в клетку

2.1 Регуляция экспрессии гена у прокариот

2.2 Способы прямого введения гена в клетку

2.3 Введение генов в клетки млекопитающих

2.4 Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих

2.5 Генотерапия

2.6 Получение трансгенных животных

Заключение

Список литературы

Введение

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А. А.). По Э. С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

Конструирование рекомбинантной ДНК;

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

История генетической инженерии

Генная инженерия появилась благодаря работам многих исследователей в разных отраслях биохимии и молекулярной генетики. На протяжении многих лет главным классом макромолекул считали белки. Существовало даже предположение, что гены имеют белковую природу. Лишь в 1944 году Эйвери, Мак Леод и Мак Карти показали, что носителем наследственной информации является ДНК. С этого времени начинается интенсивное изучение нуклеиновых кислот. Спустя десятилетие, в 1953 году Дж. Уотсон и Ф. Крик создали двуспиральную модель ДНК. Именно этот год принято считать годом рождения молекулярной биологии.

На рубеже 50 - 60-х годов были выяснены свойства генетического кода, а к концу 60-х годов его универсальность была подтверждена экспериментально. Шло интенсивное развитие молекулярной генетики, объектами которой стали E. coli, ее вирусы и плазмиды. Были разработаны методы выделения высокоочищенных препаратов неповрежденных молекул ДНК, плазмид и вирусов. ДНК вирусов и плазмид вводили в клетки в биологически активной форме, обеспечивая ее репликацию и экспрессию соответствующих генов. В 70-х годах был открыт ряд ферментов, катализирующих реакции превращения ДНК. Особая роль в развитии методов генной инженерии принадлежит рестриктазам и ДНК-лигазам.

Историю развития генетической инженерии можно условно разделить на три этапа. Первый этап связан с доказательством принципиальной возможности получения рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Эти работы касаются получения гибридов между различными плазмидами. Была доказана возможность создания рекомбинантных молекул с использованием исходных молекул ДНК из различных видов и штаммов бактерий, их жизнеспособность, стабильность и функционирование.

Второй этап связан с началом работ по получению рекомбинантных молекул ДНК между хромосомными генами прокариот и различными плазмидами, доказательством их стабильности и жизнеспособности.

Третий этап - начало работ по включению в векторные молекулы ДНК (ДНК, используемые для переноса генов и способные встраиваться в генетический аппарат клетки-рецепиента) генов эукариот, главным образом, животных.

Формально датой рождения генетической инженерии следует считать 1972 год, когда в Стенфордском университете П. Берг, С. Коэн, Х. Бойер с сотрудниками создали первую рекомбинантную ДНК, содержавшую фрагменты ДНК вируса SV40, бактериофага и E. coli.

1 Основные группы ферментов генетической инженерии

Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

Ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

Ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

Ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

1.1 Рестриктазы

Общепринято термины "рестриктаза", "эндонуклеаза рестрикции" и "сайт специфическая эндодезоксирибонуклеаза" считать синонимами.

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Наряду с рестрикционной активностью бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК; для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания.

Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3.

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве кофакторов.

В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2, однако среди ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают ДНК в одних и тех же точках, и ложную, когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта.

Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, узнаваемая рестриктазой R1 из E. coli.

К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - Eco R I (из Escherichia coli) и Hind III. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.

Как показывают многочисленные исследования, использование различных вирусов является весьма эффективным решением, которое позволяет пробраться через имунную защиту организма , а затем инфицировать клетки, используя их для распространения вируса. Для осуществления данной процедуры, генные инженеры выбрали наиболее подходящие вирусы из группы ретровирусов и аденовирусов. Ретровирусы привносят генетическую информацию в виде рибонуклеиновой кислоты (РНК), молекулы, похожей на молекулу ДНК, которая помогает перерабатывать генетическую информацию, сохраненную в ДНК. Как только удается проникнуть вглубь так называемой клетки-мишени, из молекулы РНК получается копия молекулы ДНК. Данный процесс называется обратной транскрипцией. Как только новая молекула ДНК оказывается присоединенной к клетке, все новые копии клеток будут содержать этот модифицированный ген.

Аденовирусы несут генетическую информацию сразу в виде ДНК, который доставляется в неделящуюся клетку. Хотя эти вирусы доставляют ДНК непосредственно в ядро клетки-мишени , ДНК не совмещается с геномом клетки. Таким образом, модифицированный ген и генетическая информация не передаются дочерним клеткам. Преимуществом генной терапии, проводимой с помощью аденовирусов, заключается в том, что существует возможность введения генов в клетки нервной системы и в слизистую оболочку дыхательных путей, опять же, посредством вектора. Кроме того, существует и третий метод генной терапии, осуществляемый посредством так называемых аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы содержат относительно небольшое количество генетической информации , и их гораздо сложнее вывести, чем ретровирусы и аденовирусы. Однако преимущество аденоассоциированных вирусов заключается в том, что они не вызывают реакции иммунной системы человека.

Генеалогический метод антропогенетики

В основе этого метода лежит составление и анализ родословных. Этот метод широко применяют с древних времен и до наших дней в коневодстве, селекции ценных линий крупного рогатого скота и свиней, при получении чистопородных собак, а также при выведении новых пород пушных животных.

Как метод изучения генетики человека генеалогический метод стали применять только с начала XX столетия, когда выяснилось, что анализ родословных, в которых прослеживается передача из поколения в поколение какого-то признака (заболевания), может заменить собой фактически неприменимый в отношении человека гибридологический метод.

При составлении родословных исходным является человек - пробанд, родословную которого изучают. Обычно это или больной, или носитель определенного признака, наследование которого необходимо изучить. При составлении родословных таблиц используют условные обозначения, предложенные Г. Юстом в 1931 г. (рис. 6.24). Поколения обозначают римскими цифрами, индивидов в данном поколении - арабскими.

С помощью генеалогического метода может быть установлена наследственная обусловленность изучаемого признака, а также тип его наследования (аутосомно-доминантный, аутосомно-рецессивный, X-сцепленный доминантный или рецессивный, Y-сцепленный). При анализе родословных по нескольким признакам может быть выявлен сцепленный характер их наследования, что используют при составлении хромосомных карт. Этот метод позволяет изучать интенсивность мутационного процесса, оценить экспрессивность и пенетрантность аллеля. Он широко используется в медико-генетическом консультировании для прогнозирования потомства. Однако необходимо отметить, что генеалогический анализ существенно осложняется при малодетности семей.

Процесс введения рекомбинантной ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией . Результатом трансформации является приобретение клеткой-хозяином новых последовательностей ДНК и, следовательно, новых фенотипических признаков, например - устойчивости к определенным антибиотикам. Клетка-хозяин, используемая в таких экспериментах, должна иметь определенный фенотип, в частности r - , т.е. в ней не должно быть ферментов рестрикции; онадолжна быть неспособна к общей рекомбинации (recA -) , чтобы экзогенная ДНК не модифицировалась в результате гомологичной рекомбинации. Одна из самых широко используемых для этих целей культур – это лабораторный штамм бактерий E.coli – штамм К12.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Компетентность E. coli необходимо индуцировать, а некоторые другие бактерии обладают этим свойством изначально. Долю компетентных клеток можно повысить, используя специальную питательную среду или условия культивирования. Для бактерий, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Самыми часто применяемыми в лабораторной практике приемами трансформации бактериальных клеток являются:

Трансформация E.coli с помощью обработки хлоридом кальция;

электропорация – увеличение проницаемости клеток под воздействием импульса тока длительностью ~4,5 мс;

Результаты трансформации можно оценивать количественно: определяя либо частоту , либо эффективность трансформации.

Частота трансформации – доля клеток в клеточной популяции, получивших чужеродную ДНК; выражается числом трансформантов к общему числу клеток.

Эффективность трансформации - число трансформантов в расчете на 1 мкг ДНК, взятой для трансформации.

Информация по клонированию рекомбинантных ДНК с помощью плазмидного вектора pBR322, изложенная в данном разделе, суммирована в виде схемы эксперимента и представлена на рисунке 20.

Рис. 20. Клонирование ДНК в плазмидном векторе pBR322

1, 2, 3, 4 и 5 – этапы процедуры клонирования (см. текст).

1. ДНК pBR322 разрезают эндонуклеазой рестрикции PstI в участке, определяющем устойчивость к ампициллину.

2. Фрагменты донорной ДНК, также полученные с помощью PstI и имеющие липкие концы, как и линеаризованный вектор pBR322, с помощью ДНК-лигазы сшивают с векторной ДНК. Следствием образования такой конструкции является деструктурирование гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину. Таким образом, созданная рекомбинантная ДНК при введении в клетки E.coli не сможет обеспечить им выживание на среде с ампициллином.

3. Клетки E.coli трансформируют рекомбинантной ДНК.

4. Суспензию клеток после проведения процедуры трансформации высевают на чашки с агаром и питательной средой, содержащей антибиотик тетрациклин. На этом этапе происходит селекция, т.е. отбор клеток, которые способны расти на среде с тетрациклином. Выросшие на этом агаре клетки содержат рекомбинантную ДНК и ДНК pBR322, в которую не встроилась вставка донорной ДНК, т.е. восстановилась первоначальная структура вектора.

5. Индивидуальные колонии клеток E.coli , выросшие на чашке с тетрациклином пересевают на чашки две чашки, одна из которых содержит агар с ампициллином, а вторая – с тетрациклином. Клетки, содержащие рекомбинантную плазмидную ДНК, растут только на агаре с тетрациклином, поскольку ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину у них деструктурирован за счет встраивания донорной ДНК. В то время как клетки с исходной, т.е. восстановленной векторной ДНК pBR322 растут на обеих чашках, поскольку гены устойчивости к обоим антибиотикам находятся в нативном, т.е. в исходном состоянии.

Из клеток отобранных клонов E.coli экстрагируют плазмидную ДНК и анализируют ее структуру.

Другие плазмидные векторы

Эпоха вектора pBR322, начатая Боливаром и Родригесом в самом начале 80-тых годов ХХ-го столетия, продолжается и по сей день. Однако, при всей своей надежности и классическом соответствии всем необходимым для векторов требованиям, этот вектор имеет всего несколько удобных сайтов для клонирования. Кроме того, отбор трансформированных клеток в экспериментах с рекомбинантными ДНК на его основе занимает много времени. Возникла необходимость разработки альтернативных, более совершенных, систем клонирования. Так была создана группа векторов семейства pUC. В названии векторов этого семейства буквы ”U” и “C” – это первые буквы от слов University of California . Исследователями этого университета была создана серия векторов, имебющих важную черту– наличие в структуре ДНК встроенного синтетического полилинкера , который представляет собой последовательность нуклеотидов, составленную из сайтов узнавания ряда эндонуклеаз рестрикции, уникальных для данного вектора - MCS (Multiple Cloning Sites). Названия индивидуальных векторов из семейства pUC отличаются двузначным числом, а первичная структура разных векторов отличается составом сайтов MCS MCS – Multiple Cloning Sites в полилинкере.

Рассмотрим подробнее особенности векторов, входящих в эту группу, на примере вектора pUC19 (рис. 21).

Плазмида pUC19 имеет длину 2686 п. н. и содержит: ген устойчивости к ампициллину; регулируемый сегмент гена β-галактозидазы (lacZ") лактозного оперона E.coli, ген lacI, кодирующий репрессор, который контролирует экспрессию гена lacZ"; полилинкер - короткую последовательность с множеством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз (EcoRI, SacI, КрпI, ХmаI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HinсII, AccI, BspMI, PstI, SphI и HindIII); точку начала репликации плазмиды ColE1.

Рис. 21. Плазмидный вектор pUC19

Объяснение к карте дано в тексте.

Присутствие в плазмиде pUC19 гена, обеспечивающего устойчивость к ампициллину, позволяет отбирать клоны E.coli, содержащие данный вектор или рекомбинантные ДНК на его основе на питательных средах с этим антибиотиком. Такие модульные элементы структуры рассматриваемого вектора как lacZ" , lacI и MCSдают возможность ускорить и интенсифицировать процедуру селекции клонов с рекомбинантными ДНК.

Если клетки, содержащие немодифицированную плазмиду pUC19, выращивать в присутствии изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ), который является индуктором lac- оперона, то продукт гена lacI, так называемый репрессор , не сможет связаться с промоторно-операторной областью гена lacZ", и как следствие будут происходить транскрипция и трансляция плазмидного фрагмента гена lacZ". Продукт этого фрагмента свяжется с белком, кодируемым хромосомной ДНК (α-комплементация ), и в результате образуется активная ß-галактозидаза. Последовательность с множеством сайтов рестрикции (полилинкер) встроена в ген lacZ" так, что она не влияет на продукцию функциональной β-галактозидазы, и если в среде присутствует ее субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), то он будет гидролизоваться под действием этого фермента с образованием продукта синего цвета, окрашивающего колонии клеток, содержащих немодифицированную, т.е. без вставки чужеродной ДНК, плазмиду pUC19 (рис. 22).

Рис. 22. Последовательность процедур клонирования ДНК в векторе pUC19.

1, 2, 3 и 4 – этапы клонирования (см. текст)

1. Донорную ДНК обрабатывают одной из эндонуклеаз рестрикции, для которой имеется сайт в полилинкере. Векторную ДНК pUC19 обрабатывают тем же ферментом

2. Лигирование линеаризованного вектора и вставки с помощью ДНК-лигазы Т4.

3. После процедуры лигирования инкубационной смесью проводят трансформацию клеток, способных к α-комплементации, которые могут синтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с продуктом гена lacZ" с образованием активного фермента.

4. Обработанные клетки высевают на питательную среду с ампициллином, ИПТГ и субстратом для ß-галактозидазы. Нетрансформированные клетки не могут расти в присутствии ампициллина, а клетки, несущие интактную плазмиду, образуют на среде с ампициллином колонии синего цвета. Клетки-хозяева, несущие гибридную, т.е. рекомбинантную, плазмиду, образуют на той же самой среде белые колонии. Это связано с тем, что обычно при встраивании в полилинкер чужеродной ДНК не может образовываться полноценный продукт гена lacZ" , и, следовательно, в процессе α-комплементации не образуется активная ß-галактозидаза, расщепляющая субстрат X-Gal до продукта, который и обеспечивает окрашивание клеток колоний в синий цвет.

Векторы на основе бактериофага λ

Плазмидные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК, размеры которых не превышают 10 т.п.н. Однако для решения задачи клонирования хромосомной ДНК даже небольшого организма, например – бактерии, необходимо создавать полные коллекции фрагментов этой ДНК, поэтому часто приходится работать с более крупными фрагментами. Для этого были разработаны векторы на основе бактериофага λ Ε. coli.

При проникновении фага λ в клетки E.coli. существуют два альтернативных пути развития событий:

1. Литический цикл – фаг начинает активно размножаться и примерно через 20 минут клетка разрушается с высвобождением до 100 новых фаговых частиц.

2. Состояние лизогении – фаговая ДНК включается в хромосому E.coli как профаг и реплицируется в клетке вместе с нормальными бактериальными клетками. Однако при неблагоприятных условиях (нехватка питания) запускается литический цикл (рис. 23):

1. При репликации кольцевой ДНК бактериофага λ образуется линейная молекула, состоящая из повторяющихся сегментов длиной примерно 50 т.п.н. Каждый из этих сегментов представляет собой полноразмерную фаговую ДНК, фланкированную липкими cos -сайтами - одноцепочечными 5"-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos ) концами, поскольку они взаимно комплементарны и могут спариваться друг с другом подобно липким концам рестрикционных фрагментов.

2. Фаговая головка вмещает один такой сегмент, затем к головке присоединяется уже собранный отросток.

Рис. 23. Литический путь развития бактериофага λ

1 – упаковка в головку фага одного сегмента полноразмерной фаговой ДНК; 2 – сборка полноценной фаговой частицы.

Размер ДНК фага λ составляет примерно 50 т. п. н., причем значительная ее часть (около 20 т. п. н.) несущественна для размножения фага и отвечает за его встраивание в хозяйскую ДНК. В связи с этим возникла идея, что ее можно заменить фрагментом другой ДНК эквивалентного размера. Образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного" фага, “вставшего" на литический путь развития. Рекомбинантные молекулы упаковывают в головки бактериофага λ in vitro и после добавления отростков получают инфекционные фаговые частицы (рис. 24).

Рис. 24. Использование векторов на основе фага λ для клонирование фрагментов ДГК в клетках Ε. сoli .

Приготовление экстрактов для осуществления упаковки in vitro ДНК фага λ проводят с помощью двух штаммов E.coli , каждый из которых лизогенен в отношении определенного мутантного штамма фага λ (рис. 25). Один из мутантов не способен синтезировать белок А (один из полипептидов фаговой терминазы), другой – белок Е (белок головки фага). Оба этих белка необходимы для упаковки ДНК фага λ. “А”- и “Е”-экстракты смешивают и добавляют конкатемерную (сегменты полноразмерной фаговой ДНК, полимеризованные по cos -сайтам) ДНК фага, которая связывается с терминазой прежде, чем происходит разрезание в cos -сайтах, и упаковывается в фаговые головки.

Рис. 25. Упаковка in vitro ДНК фага λ

При упаковке молекулы ДНК длиной менее 38 т.п.н. получается неинфекционная фаговая частица, а фрагменты длиной более 52 т, п. н. не умещаются в головку. Сегменты длиной 50 т. п. н. в линейной молекуле ДНК разделены cos-сайтами, и именно по этим сайтам разрезается молекула, когда очередной сегмент заполняет головку. Разрезание осуществляет фермент, находящийся у входа в головку.

Процесс введения рекомбинантной фаговой ДНК со встроенным фрагментом чужеродной генетической информации в клетки-реципиенты основан на естественном природном явлении – трансдукции фаговой ДНК.

Трансдукция (лат. transduction - перемещение) представляет собой процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Таким образом, трансформация бактериальных клеток с помощью рекомбинантных ДНК на основе фаговой ДНК не требует специальной подготовки клеток-реципиентов или какого-либо специального приборного оснащения.

Для поиска клеток, содержащих фаги с рекомбинантными ДНК, используют методы молекулярной гибридизации и иммунологический скрининг, которые рассмотрим в следующем разделе.

8860 0

В настоящее время известно около 40 различных способов доставки рекомбинантной ДНК в клетки, по-разному решающих проблему преодоления плазматической мембраны. Пока не существует единой классификации методов доставки рекомбинантной ДНК в клетки. Каждый автор обзоров классифицирует по-своему, возможно, потому, что для многих эмпирически найденных методов механизм преодоления мембраны не ясен до сих пор, например для трансформации. С терминологией также существует неопределенность, что неудивительно для бурно развивающейся новой области науки и практики.

Каждый из методов доставки чужеродной ДНК в клетки имеет свои особенности, преимущества и недостатки в отношении выживаемости клеток, эффективности введения, универсальности, возможностей технического осуществления. Выбор метода зависит от типа клеток-хозяев и типа использованного вектора, а также от личных предпочтений и возможностей экспериментатора. Ниже подробно рассмотрены некоторые наиболее известные способы доставки ДНК в клетки-мишени.

Трансформация в самом общем значении - это процесс введения свободной ДНК в клетку. В более узком значении термин применяется в основном по отношению к бактериям, обозначая процесс поглощения рекомбинантной ДНК компетентными клетками, индуцированный температурным фазовым переходом клеточной мембраны. E. coli является самым распространенным организмом при работе с рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить внедрение в клетки плазмидной ДНК, клетки выдерживают с ледяным раствором СаС12 и ДНК, а затем подвергают тепловому шоку при 42 °С в течение ~1 мин.

По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК,
при этом составляет примерно 10000 - 10000000 . Эффективность этого метода невысока, приблизительно менее 0,1 % клеток оказываются трансформированными, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать нужные клоны.

Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными. Доля этих клеток в популяции обычно очень мала, но ее можно повысить, используя специальную питательную среду, условия культивирования и химические индукторы компетентности (подобранные, как правило, эмпирически). Часто используемый этап подготовки компетентных клеток получение сферопластов - клеток, частично или полностью (протопласты) лишенных наружной ригидной клеточной стенки.

Например, только таким способом была осуществлена эффективная трансформация многих грамположительных бактерий родов Bacillus, Listeria, Streptommyces и др. Некоторые методики трансформации дрожжей также включают стадии ферментативного удаления оболочки дрожжевой клетки с помощью глюкозидаз. Для организмов, устойчивых к химическим индукторам компетентности или не обладающих природной компетентностью, применяются другие системы доставки ДНК.

Конъюгация. Существуют бактериальные плазмиды (конъюгативные плазмиды), обладающие способностью создавать межклеточные контакты, через которые они и переходят из одной клетки в другую. Образование контактов между донорной и рецепиентной клетками обеспечивается конъюгативными свойствами плазмид, а сам перенос ДНК - мобилизационными. При этом конъюгативная плазмида может увлекать за собой обычный плазмидный вектор, находящийся в той же клетке.

Таким образом можно трансформировать клетки-реципиенты, с трудом поддающиеся трансформации другими способами. Например, показан мобилизационный перенос челночного вектора pAT187 с широким кругом хозяев из E. coli в различные грамположительные бактерии (родов Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), хотя и с намного меньшей эффективностью, чем для переноса между разными штаммами E. coli.

Более того, недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных. В процессе конъюгации переносится только одна цепь донорской плазмиды, на которой затем синтезируется вторая цепь. Это приводит к тому, что конъюгативно передаваемая плазмида не подвергается атаке хозяйских рестриктаз. Эффективность этого метода для бактерий сопоставима с трансформацией.

Вирусная инфекция. Для внедрения векторов на основе вирусов широко используется природный инфекционный путь заражения клетки-хозяина, который зависит от типа вируса.

Перфорационные методы. Одним из популярных методов введения нуклеиновых кислот в клетки-мишени является электропорация - временное создание пор в бислойной липидной мембране под кратким воздействием электрического поля. Является универсальным физическим методом трансформации, методика которого разработана практически для всех типов клеток.

При работе с E. coli подготовленную клеточную суспензию (~50 мкл) и ДНК помещают между электродами и подают единичный импульс тока длительностью ~4,5 мс при напряжении 1,8 кВ, расстояние между электродами составляет 1 мм. После такой обработки эффективность трансформации повышается до 109-1011 для малых плазмид (~3-6 тпн) и до 106 для больших (~135 тпн). Аналогичные условия используют для введения в Е. coli вектора ВАС.

Электропорирующий эффект высоковольтного разряда на бислойную липидную мембрану, по-видимому, зависит от радиуса ее кривизны. Поэтому мелкие бактериальные клетки эффективно поглощают ДНК при значительно большей напряженности (12-18 кВ/см), чем крупные животные и растительные клетки, эффективно поглощающие ДНК при напряженности поля 1-2 кВ/см. Электропорация - наиболее простой, эффективный и воспроизводимый метод введения молекул ДНК в клетки, требующий, однако, специального прибора электропоратора.

Другие перфорационные методы доставки ДНК в клетку: обработка клеток ультразвуком, соскабливание клеток с субстрата в присутствии экзогенного материала, центрифугирование клеток в среде с ДНК в сочетании с электропорацией, осмотическая перфорация плазматической мембраны, пробой клетки лазерным микролучом, использование порообразующего токсина стрептолизина-О.

Трансфекция. Первоначально этот термин обозначал введение в клетки вирусной ДНК, сейчас его значение расширилось до обозначения введения любой чужеродной ДНК в клетки эукариот. Термин «трансформация», обозначающий процесс введения ДНК в клетку для прокариот и дрожжей, оказалось, использовать неудобно, поскольку применительно к животным клеткам трансформация - это превращение нормальных клеток в раковые. В узком смысле под трансфекцией в основном понимают введение ДНК в эукариотические клетки с помощью различных химических реагентов.

Одним из первых разработанных методов эффективной трансфекции была инкубация ДНК с ДЕАЕ-декстраном. Полученная эффективность была сопоставима с трансформацией бактерий и достигала 106 трансфектантов на мкг ДНК.

Механизм действия ДЕАЕ-декстрана окончательно не установлен, но известно, что он связывается с ДНК и с клеточной мембраной, стимулируя пиноцитоз (рис. 2.8), хотя сам клетками не захватывается. К недостаткам метода стоит отнести токсичность ДЕАЕ-декстрана для некоторых типов клеток, зависимость эффективности от качества препарата, очень малую частоту получения стабильных трансфектантов.

Рис. 2.8. Схема введения ДНК в составе различных комплексов в клетку путем эндоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематичное изображение частицы из нелипидного поликатиона в дендроформе со связавшейся ДНК, отрицательный заряд которой компенсируется катионным полимером (б)

Эффективность трансфекции удалось повысить в 10-100 раз инкубацией клеток с осажденной фосфатом кальция ДНК. Плотные частицы кальциевого преципитата ДНК поглощаются клеткой путем фагоцитоза (рис. 2.8), но при этом только небольшая часть проникших молекул достигает ядра и встраивается в хромосомную ДНК. Кальций-фосфатный метод более эффективен и дешев, но вызывает разрыв молекул ДНК, что переводит кольцевые молекулы в линейную форму, иногда неинфекционную в случае трансфекции вирусов. Кроме того, условия кальций-фосфатной трансфекции приходится подбирать для каждых клеток-мишеней индивидуально.

В ходе поисков других трансфецирующих реагентов было выявлено, что полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность трансфекции. Полимерные катионы образуют с нуклеиновыми кислотами устойчивые комплексы с нейтрализованными зарядами, которые могут с высокой эффективностью транспортировать ДНК и РНК внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз на пути к ядру (рис. 2.9).

Рис. 2. 9. Схема транспорта ДНК в ядро клетки в составе комплекса поликатион-ДНК, связанного со специфическим лигандом, путем лиганд-опосредованного эндоцитоза

Синтетические нелипидные полимерные катионы в линейной или разветвленной конформации (дендритная форма) могут конденсировать ДНК и РНК в относительно малые частицы, которые затем связываются с клеточной мембраной и проникают в клетку путем неспецифического эндоцитоза. В настоящее время для трансфекции из группы нелипидных поликатионов используются в основном полиэтиленимин, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные белки типа полилизина, протамина и гистонов, а также различные коммерческие продукты, например PAMAM.

Революцией явилось введение в практику первого низкотоксичного катионного липида ДОТМА (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером (Feigner, 1987) с соавторами. Эффективность трансфекции с использованием катионного липида (рис. 2.10) была приблизительно в 100 раз больше относительно любого другого химического реагента, причем с большой долей стабильных трансгенных клеток.

Рис. 2. 10. Структура комплекса с ДНК (а) и общая структура катионного ли-пидного полимера (б). Катионные липидные полимеры (линейные и разветвленные), похожие по своей структуре и свойствам на клеточные мембранные фосфолипиды формируют комплексы с ДНК в виде многослойных катионных липосом (а) при простом смешивании реагентов. Такие комплексы проникают в клетку путем эндоцитоза или слияния с клеточной мембраной через липидную часть

Одновременно был введен в практику новый термин «липофекция», подчеркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липид-катионные комплексы к инфекционным вирусным частицам.

Развивая успех, были разработаны многочисленные вариации этих соединений (липофектин, липофектамин, селлфектин и др.).

Параллельно разрабатывались средства доставки на основе фосфолипидных липосом, начиненных ДНК или РНК.

Маленькие сферы из искусственных мембран могут сливаться с плазматическими мембранами клеток или поглощаться эндоцитозом, высвобождая содержимое внутрь клетки. Небольшую эффективность липосомной трансфекции повысило введение в структуру липосом фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, способные инициировать слияние мембран.

Липосомный метод достаточно капризен и требует тщательного подбора всех условий для эффективной трансфекции конкретных клеток. Кроме того, процедура инкапсулирования, обычно обработка ультразвуком, часто повреждает крупные молекулы ДНК.

Новым этапом в развитии трансфекционных реагентов стала разработка более эффективной и адресной доставки в специфические клетки-мишени нуклеиновых кислот путем введения в структуру синтетических трансфекционных реагентов и липосом различных лигандов для связывания с мембранными белками-рецепторами. Наличие таких адресных групп (лигандов), узнаваемых клеточными рецепторами, позволяет использовать механизмы лиганд-опосредованного эндоцитоза (см. рис. 2.9).

В качестве таких лигандов используют белки и пептиды, узнаваемые рецепторами; олигосахариды, поскольку на поверхности многих животных клеток присутствуют лектины -белки-рецепторы, специфически их связывающие; полисахариды. Процессы взаимодействия с клетками таких адресных комплексов ДНК(РНК)-трансфекционный реагент имеют сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.

В настоящее время биотехнологические фирмы предлагают широкий спектр разнообразных трансфекционных реагентов - от самых простых и дешевых до самых последних разработок, специализированных под разные типы клеток и задачи. Также интенсивно продолжается создание новых еще более эффективных трансфецирующих реагентов.

Микроинъекция - клеточная мембрана прокалывается микроиглой и раствор, содержащий ДНК, вводится в цитоплазму клетки или напрямую в ядро, если ядро достаточно большое (например, ядро яйцеклетки). Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала возможной с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1-0,5 мк и микроманипулятора. Метод очень эффективен, доля клеток со стабильной интеграцией и экспрессией инъецированных генов может достигать 50 %. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Баллистическая трансфекция, биобаллистика, или биолистика (бомбардировка микрочастицами), основана на обстреле клеток микросферами размером около 1 -2 мкм, покрытых ДНК. Применяются микрочастицы золота, вольфрама (иногда бывает фитотоксичен), силикона и различные синтетические наносферы. Микрочастицы, покрытые ДНК, проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в органеллы и ядра клеток. Созданный для этой цели «генный пистолет» (gene gun), или «генная пушка», который был разработан Д. Сенфордом (J. Sanford) в 1987 г. для введения ДНК в зерна хлебных злаков, по своему устройству сходен с пневматическим оружием (рис. 2.11).

Рис. 2.11. Введение рекомбинантной ДНК в листья растения с помощью многоразового «генного пистолета» фирмы Bio-Rad (а) и его общая схема (б). Гелиевый импульс выбрасывает микрочастицы, покрытые ДНК или РНК, из капсулы с образцом. Микрочастицы, несущие ДНК, ускоряются и фокусируются для максимального проникновения в клетки, продвигаясь по разгоночному каналу и по стволу пистолета, при этом на широком выходе поток гелия диффузно расходится в стороны. Фильтр-спейсер поддерживает оптимальную дистанцию для поражения цели с максимальным удалением гелия, чтобы свести к минимуму повреждающие воздействия на поверхность клеток

Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика - до 1 мм, однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить гены, например, в волокна поперечно-полосатых мышц. Баллистическая трансфекция очень эффективна даже там, где толстые клеточные стенки (дрожжи, растения) являются препятствием для многих других методов доставки, и применяется в том числе для тканей, органов и даже целых организмов. В настоящее время широко используется в генотерапии, для получения трансгенных животных и растений.

Такое разнообразие средств и методов трансфекции обусловлено различными задачам, широким спектром используемых клеток-мишеней и типов доставляемых в клетки нуклеиновых кислот, а также потребностями общества в получении все более эффективных средств доставки генетической информации в клетки, ткани и целые организмы. Особое внимание уделяется развитию трансфекционных реагентов и методов в связи с поразительными перспективами генной терапии человека, для которой необходимы адресные высокоэффективные и безопасные средства генной доставки.

Стабильное и транзиентное внедрение чужеродной ДНК в клетку. После введения рекомбинантной ДНК в эукариотическую клетку, лишь ее малая часть оказывается в ядре, поскольку ядерная мембрана является труднопреодолимым барьером для чужеродной ДНК. В ядре рекомбинантная ДНК может быть интегрирована в хромосому или некоторое время существовать во внехромосомном состоянии.

Соответственно, различают стабильную трансфекцию, когда рекомбинантные ДНК интегрируются в хромосомы клеток-реципиентов и становятся их неотъемлемой частью, а также временную, или транзиентную, трансфекцию (transient transfection), при которой молекулы рекомбинантной ДНК существуют и транскрибируются в ядрах во внехромосомном состоянии непродолжительное время. Стабильное наследование внедренной чужеродной ДНК - основное условие получения трансгенных организмов для хозяйственных целей.

Поэтому разработке методов введения ДНК в клетки, ведущих к получению большей доли стабильных трансформантов, уделяется особое внимание. Кроме того, большой процент стабильных трансформантов, также позволяет отказаться от селективных и маркерных генов, являющихся балластными при создании трансгенных организмов.

Н.А. Воинов, Т.Г. Волова