Фагоцитоз Клетки не только способны образовывать псевдоподии, сжимаясь, они выделяют обволакивающие пластинки для фиксации чужеродных частичек, таких как частички пыли, микробы, остатки мертвых, дегенерированных клеток.Тот факт, что лейкоциты и другие подвижные

Иммунитет Иммунитет (лат. immunitas – «освобождение от чего-либо») защита организма от генетически чужеродных организмов и веществ, к которым относят микроорганизмы, вирусы, черви, различные белки, клетки, в том числе и собственные измененные. ВНИМАНИЕ Благодаря иммунитету

Сущность фагоцитоза можно описать буквально в нескольких словах. При этом процессе особые клетки-фагоциты «вычисляют», пожирают и переваривают вредные частицы, попавшие в организм, главным образом инфекции . Цель явления состоит в том, чтобы защитить нас от потенциальных патогенов, токсинов и так далее. А как именно осуществляется механизм фагоцитоза? Он проходит в несколько этапов, о которых будет подробнее рассказано ниже.

Этапы фагоцитоза:

Хемотаксис

Вредоносный объект проникает в организм, и он недолго остается там незамеченным. Этот объект, будь то бактерия, инородное тело или что-то еще, выделяет особые вещества (хемоаттрактанты) и прямо контактирует с кровью или тканями. Все это ставит организм в известность о присутствии внутри него агрессора.

Возникает каскад биохимических реакций. На первой стадии фагоцитоза тучные клетки выбрасывают в кровь специальные соединения, вызывающие реакцию воспаления. Начало воспалительного процесса «пробуждает» от состояния покоя макрофаги и другие клетки-фагоциты . Нейтрофилы, уловив присутствие хемоаттрактантов, быстро выходят из крови в ткани и спешат мигрировать к воспалительному очагу.

Сложно это описать, а еще сложнее себе это представить, но проникновение патогена в организм ведет к запуску настоящего эффекта домино, включающего сотни (!) различных физиологических явлений, проходящих на клеточном и субклеточном уровнях. Состояние иммунной системы на этом этапе фагоцитоза можно сравнить с состоянием потревоженного пчелиного улья, когда его многочисленные обитатели готовятся атаковать обидчика.

Адгезия

Последовательность фагоцитоза продолжается второй стадией - реакцией адгезии. Подошедшие к нужному месту фагоциты протягивают к патогену свои отростки, вступают с ним в контакт и распознают его. Они не спешат сразу нападать и вначале предпочитают убедиться, не ошибаются ли они на счет «чужака». Распознание вредоносного агента происходит при помощи особых рецепторов на поверхности мембран фагоцитов.

Активация мембраны

На третьей стадии фагоцитоза в клетках-защитниках происходят невидимые реакции, которые подготавливают их к захвату и уничтожению патогена.

Погружение

Мембрана фагоцита - это текучая, пластичная субстанция, которая может менять форму. Что она и делает, когда клетка сталкивается с вредоносным объектом. На фото видно, что фагоцит протягивает к чужеродной частице свои «щупальца». Потом он постепенно растекается вокруг нее, наползает на нее и полностью ее захватывает.

Образование фагосомы

Когда фагоцит охватывает частицу со всех сторон, его мембрана замыкается снаружи, а внутри клетки остается закрытый пузырек с атакованным объектом внутри. Таким образом, клетка как будто проглатывает частицу. Этот пузырек носит название фагосомы.

Формирование фаголизосомы (слияние)

Пока проходили другие этапы фагоцитоза, внутри фагоцита готовилось к использованию его оружие - органеллы-лизосомы, содержащие «пищеварительные» ферменты клетки. Как только бактерия или другой вредный объект оказался пленен клеткой-защитником, к ней приближаются лизосомы. Их мембраны сливаются с оболочкой, обволакивающей частицу, и их содержимое изливается внутрь этого «мешка».

Киллинг

Это самый драматичный момент во всем механизме фагоцитоза. Захваченный объект переваривается и расщепляется фагоцитом.

Удаление продуктов расщепления

Все, что осталось от убитой бактерии или другой переваренной частицы, удаляется из клетки. Бывшая фаголизосома, представляющая собой мешочек с продуктами деградации, подходит к наружной мембране фагоцита и сливается с ней. Так из клетки удаляются остатки поглощенного объекта. Последовательность фагоцитоза завершается.

От чего зависит успешность фагоцитоза?

Увы, не всегда весь описанный процесс проходит как по маслу. В некоторых случаях патоген оказывается сильнее фагоцитарного звена иммунитета , он перебарывает защиту, и человек заболевает. Еще Мечников замечал, что если на личинок и червей подействовать слишком большим количеством грибковых клеток, то зараженные организмы погибают.

Другая возможная причина неудачи - незавершенный фагоцитоз . Некоторые (часто очень опасные и заразные) возбудители защищены от переваривания фагоцитами. В результате они просто проникают внутрь них, живут там и развиваются, недоступные для других факторов защиты иммунитета. Ведь «нормальная» иммунная система не будет атаковать собственные же клетки, она не знает, что внутри них - опасный возбудитель…

Чтобы избежать «неудачного» фагоцитоза и обеспечить наилучшую иммунную защиту, рекомендуется принимать препарат Трансфер Фактор . Его информационные молекулы передают клеткам иммунитета сведения о том, как вести себя с самыми разными патогенами и как от них избавляться. В результате работа иммунитета налаживается, а это повышает его устойчивость к еще не возникшим болезням и эффективность излечения от уже развившихся.

В литературе описано большое число методов количественной оценки фагоцитоза. Объем настоящей книги не позволяет подробно изложить все из них, поэтому мы ограничимся описанием лишь некоторых.

Материалы и оборудование

Для работы необходимо иметь:

Цитратдекстрозный антикоагулянт: 8 г лимонной кислоты,. 22 г трехзамещенного цитрата натрия (двухводного), 24,5 г глюкозы растворяют в 1 л воды;

Раствор декстрозодекстрана: 4,5 г NaCl, 25 г глюкозы, 30 г декстрана (отн. мол. масса 500 000) в 1 л;

Раствор хлористого аммония: 9 частей 0,83% хлористого аммония, 1 часть трис-НСl-буфера с рН 7,2 (20,6 г/л);

Смесь фиколл - визотраст: 9 г фиколла, 20 мл визотраста, 100 мл бидистиллированной Н 2 0, плотность 1,077;

Субстрат для β-глюкуронидазы: 31,5 мг паранитрофенил-β-глюкуронида и 100 мкм тритон X 100 растворяют в 100 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера с рН 5;

Реагенты для определения дефицита миелопероксидазы: фиксатор (10 мл 37% формальдегида с 90 мл абсолютного этанола), субстратный раствор (100 мл 30% ЭДТА, 0,3 г хлористого бензидина, 0,038 г ZnS0 4 x7H 2 0, 1 мл дистиллированной воды, 1,0 г CH 3 C00Nax3H 2 0, 0,7 мл 3% Н 2 0 2); подводят рН 1,0 М NaOH до 6,0.

Коммерческие реагенты:

ФСБ, раствор Хенкса и среда Игла-MEM (Гос. институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин-Вайсензее, ГДР);

Гепарин (5000 ЕД/мг) (Gedeon Richter, Венгрия);

Сыворотка эмбрионов коров (Flow Laboratories, США, можно другой фирмы);

Визотраст (VEB Fahlberg List, Magdeburg, ГДР);

Инфуколл (VEB Serumwerk Bernburg, ГДР);

Декстран, фиколл (Pharmacia, Швеция);

Коллоидный уголь Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, ФРГ);

Диизодецилфталат, парадиоксан (Coleman, Matheson and Bell, США);

Тритон X 100 (Serva, ФРГ, можно другой фирмы);

Масляный красный О (Allied chemical corp., Morristown, NY, США);

Иаранитрофенил-β-глюкуронид (Sigma, США);

Сафранин О (Fischer Scientific Lab., Chicago, США);

Полистироловые бусы, трубочки (Nunc, Дания);

Сетка F 905 (VEB Orvo Wolfen, ГДР).

Получение фагоцитов

Необходимые сведения о выделении гранулоцитов человека можно получить в главе "Разделение клеток иммунной системы "; получение перитонеальных макрофагов см. в разделах "Культивирование макрофагов и моноцитов " и "Выделение макрофагов из суспензии сплеиоцитов ". Детально этот вопрос рассматривается в ряде работ.

Кроме того следует еще упомянуть о следующих методах:

8 мл крови смешивают с раствором декстранглюкозы. Затем добавляют 6% раствор декстрана 75 в 0,15 М NaCl (5 мл). Смесь оставляют на 45-50 мин при комнатной температуре для седиментации эритроцитов. Отсасывают плазму. Остаточные эритроциты лизируют добавлением 0,83% хлористого аммония (35 мл к 15 мл плазмы). Центрифугируют 10 минут при 80g, суспендируют осадок в охлажденном до 0°С 0,15 М NaCl. Объединяют несколько осадков и центрифугируют 10 минут при 800 g. Клетки лучше сохранять на льду в 0,15 М NaCl (эта среда больше подходит, чем забуференные среды с бивалентными катионами, которые вызывают слипание клеток);

Если объектом фагоцитоза являются дрожжи, можно опустить стадию обработки хлористым аммонием, так как эритроциты не мешают процессу. Мононуклеары можно получать следующим образом: гепаринизированную кровь смешивают с 1 / 3 объема среды Игла, содержащей 15% глюкозы, наслаивают на слой смеси фиколл - визотраст и центрифугируют 20 мин при 400 g. Фракцию мононуклеаров отсасывают пастеровской пипеткой, дважды отмывают ФСБ и готовят суспензию на среде Игла (1х10 7 клеток/мл).

Приготовление частиц для фагоцитоза

Чаще используют живые культуры Staphylococcus aureus (SG 511 или 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli и другие энтеробактерии, листерии, коринебактерии, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмы выращивают 24 часа (при необходимости 48 ч) на твердых и жидких питательных средах. Собранную биомассу трижды отмывают 0,15М NaCl. Слишком густую взвесь измеряют при 640 нм, определяют концентрацию по калибровочной кривой.

Концентрацию микроорганизмов определяют также методами рассева на плотные питательные среды; в некоторых случаях подсчет микроорганизмов можно проводить в счетных камерах.

При работе с живыми бактериальными культурами следует обращать внимание на то, чтобы использовались всегда культуры на одной и той же стадии. Добавление 0,01%бычьий сывороточный альбуминспособствует выживаемости микроорганизмов. Изготовленная суспензия остается стабильной в течение 1-2 ч.

Убитые культуры микроорганизмов обычно получают нагреванием в течение 30 минут при 80 °С или обработкой текучим паром. Убитые микробы трижды отмывают 0,15 М NaCl, ресуспендируют и определяют концентрацию суспензии.

Приготовление пекарских дрожжей: 0,5 г пекарских дрожжей суспендируют в 0,15 М NaCl и помещают на 30 мин в кипящую водяную баню. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. При использовании живых дрожжей свежие клетки (4-5-дневная культура) трижды отмывают в среде Игла с добавлением 1,0% глюкозы. Обычно используют суспензию клеток 10 8 и 10 9 клеток/мл. Дрожжи используют в качестве тест-частиц при выявлении дефектов компонента С5.

Использование взвеси частиц полистирола: готовят 10% водную суспензию частиц полистирола диаметром 1,091 мкм. Разводят ее в соотношении 1 + 1 0,2% раствором БСА в 0,15 М NaCl, центрифугируют. При длине волны 253 нм суспензия полистирола 1 мкг/мл дает поглощение 1,17х10 -3 .

Применение суспензии липополисахарид - масляный красный О в минеральном масле: 2 г масляного красного растирают в 50 мл диизодецилфталата (или вазелиновое масло) в фарфоровой ступке. Центрифугируют 20 мин при 500 g. Добавляют 10 мкг надосадочной фракции к 10 мл диоксина, измеряют оптическую плотность на длине волны 525 им. Фактор пересчета равен 0,92. На втором этапе 40 мг липополисахарид (Е. coli 0,26 В6 и др.) растворяют в 3 мл 0,15 М NaCl. Затем добавляют к этой смеси 1 мл раствора масляного красного О в диизодецилсульфате, суспендируют смесь в течение 90 секунд. Суспензию используют немедленно, ее можно замораживать.

Для постановки реакции фагоцитоза в качестве тест-частиц можно использовать формалинизированные эритроциты.

Фагоцитоз бактерий, бактерицидность

Эксперимент с суспензией живых бактерий: обычно используют соотношение 3-10 микробов/фагоцит. В общем объеме 2 мл смешивают 1x10 6 фагацитов с 3х10 6 - 1х10 7 микробов. На практике к 1 мл суспензии фагоцитов, к которому было добавлено 8 ME гепарина, приливают 1 мл суспензии бактерий. Время взаимодействия составляет обычно 30 мин, в некоторых случаях оно больше. После инкубации отбирают 0,5 мл смеси, добавляют 1,5 мл 0,1% раствора желатина в растворе Хенкса, охлажденного до 0°С, и центрифугируют 3-4 мин при 300 g. Из осадка готовят мазки, которые окрашивают по Паппенгейму. Просматривают 200 клеток (по возможности трижды). Вычисляют процент фагоцитоза. По числу содержащихся в клетках бактерий рассчитывают индекс активности фагоцитоза: число фагоцитированных бактерий умножают на процент фагоцитирующих клеток; интенсивность фагоцитоза выражают числами от 1 до 4.

Степень 1: фагоцитировано I-4 бактерий
Степень 2: фагоцитировано 5-7 бактерий
Степень 3: фагоцитировано 8-10 бактерий
Степень 4: фагоцитировано более 10 бактерий на клетку

При определении уровня фагоцитоза живых микробов отдельно проверяют осадок клеток и надосадочную фракцию. Количество живых микробов определяют по рассеву на плотные питательные среды 0,1 мл исследуемых фракций. Инкубируют 24 (48) ч. При расчете бактерицидности исходят из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одному живому микробу.

Для направленного изучения бактерицидности исследуют кровь пациентов и здоровых доноров с добавлением раствора антибиотиков (по 5000 ЕД пенициллина и стрептомицина/мл) и без него, а также проводят бактериальный контроль. Состав пробы: 0,3 мл раствора Хенкса+ 0,1 мл нормальной сыворотки, полученной из крови, взятой у 5 доноров, +0,5 мл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) +0,1 мл суспензии микробов (10 6 микробов/мл). Раствор антибиотиков вносят по 0,02 мл в пробу. Инкубируют пробы при 37 °С и определяют число микробов через 20 минут, 1,5 часа и 3 часа. Для этого отбирают по 0,1 мл из каждой пробы, разводят отобранные аликвоты раствором Хенкса в 10, 100 и 1000 раз и наносят на подогретый агар. Иногда, особенно если были добавлены антибиотики, для точного подсчета микробов готовят промежуточные разведения (например, 0,2 мл пробы смешивают с 5 мл раствора Хенкса, центрифугируют 5 минут при 450 g, осадок растворяют в 1,9 мл ФСБ, наносят на агар). Если хотят сократить длительность бактериологического исследования, можно определять находящиеся внутри клетки микробы по флюоресценции при помощи окраски акридиновым желтым.

Фагоцитоз пекарских дрожжей: готовят суспензию 10 9 клеток/мл в 0,15 М NaCl. Смешивают 0,1 мл суспензии с 0,1 мл плазмы больного, инкубируют 30 мин при 37 °С, добавляют 0,2 мл (10 6) ПМЯЛ, инкубируют 30 мин. Отбирают аликвоты через интервалы от 5 до 30 мин. Просчитывают 100 ПМЯЛ и определяют число захваченных дрожжевых частиц на клетку. Известна следующая модификация: к 50 мкл сыворотки морской свинки добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки (предварительно ее разводят в соотношении 1 + 1 средой Игла с глюкозой), добавляют 50-200 мкл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) доводят объем до 450 мкл средой Игла с глюкозой и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем добавляют 50 мкл суспензии дрожжей (10 8 клеток/мл) перемешивают, инкубируют 40 минут при 37 °С. Вносят 50 мкл L- 75 Sе-метионина (общая активность 100 кБк) перемешивают и инкубируют 1 час при 37 °С. Осаждают клетки центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g, отмывают их дважды ФСБ, измеряют радиоактивность на гамме-счетчике. Процент фагоцитированных дрожжей вычисляют по формуле:

Фагоцитоз с использованием раствора масляного красного в минеральном масле: 0,2 мл суспензии частиц смешивают с 0,8 мл клеточной суспензии, предварительно нагретой до 37°С. Через 5 минут инкубации добавляют 6 мл охлажденного до 0°С 0,15 М раствора NaCl, содержащего 126 мкг/кл N-этилмалеимида (для прекращения захвата частиц). Центрифугируют 10 минут при 250 g. Надосадочную фракцию отбрасывают, осадок ресуспендируют в растворе NaCl и N-этилмалеимида (см. выше), дважды отмывают клетки. Лизируют клетки ультразвуком, происходит высвобождение масляного красного. Добавляют 1 мл диоксана. Центрифугируют 15 минут при 500 g, измеряют оптическую плотность на волне 525 нм против чистого диоксана. Степень фагоцитоза (ИФ) определяют как количество минерального масла (мг), поглощаемого в минуту 10 7 клетками. Для подсчета можно использовать следующую формулу:

Исследование фагоцитоза в монослое макрофагов:

1. Фаза: в стерильные полистирольные пробирки вносят по 2 мл суспензии клеток (200 000 клеток/мл). Инокулируют 5 часов при 37°С, затем отмывают средой Игла. Вносят в пробирки 2 мл культуральной среды с 10% инактивированной (30 мин, 56 °С) сыворотки эмбрионов коров, инкубируют при 37 °С.

2. Фаза А: вносят суспензию микробов (3-10/макрофаг), инкубируют 30-60 мин при 37 °С, 6 раз ополаскивают пробирки порциями среды по 3 мл для удаления нефагоцитированных микробов. Немедленно фиксируют препарат смесью 1 части ледяной уксусной кислоты с 3 частями метанола. Окрашивают препарат по May - Griinwald, подсчитывают клетки.

Фаза Б: определение внутриклеточных живых бактерий. Последовательность операций та же, что и в фазе А до этапа фиксации. После отмывки тщательно удаляют все следы среды. Лизируют клетки, для чего вносят 2 мл 0,01% стерильного растворабычьий сывороточный альбумин(4°С), многократно встряхивают. Большая часть клеток лизируется через 20 минут. Высвободившиеся бактерии определяют путем рассева на плотные питательные среды.

Фагоцитоз эритроцитов: смешивают 4x10 7 фагоцитов с 5x10 7 тест-эритроцитов в 5 мл ФСБ. Переносят 2 мл смеси в охлажденный до 0°С 5 мМ фосфатный буфер и центрифугируют. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при длине волны 420 нм. Степень фагоцитоза определяют по снижению содержания гемоглобина в бесклеточной фазе при помощи калибровочных кривых.

Упрощенный метод определения клиренса

Пример определения клиренса на крысах: животным вводят внутрибрюшиино по 5х10 7 микробов на 100 г веса (0,1мл/ /100 г). Оптимальная доза может колебаться от 10 6 до 10 8 на 100 г веса. С интервалом 1-2 часа из каждой группы экспериментальных животных забивают по 3 особи; общая продолжительность эксперимента 16 часив. Стерильно берут 0,5 мл крови из сердца, 1 мл перитонеальной жидкости, выделяют легкие, печень, селезенку и почки. Из ткани органов вырезают цилиндры пастеровской пипеткой. Определяют число микроорганизмов путем культивирования на жидких и твердых питательных средах.

Пример определения клиренса на мышах: используют коллоидный уголь или меченные 51 [Сг] эритроциты барана. Мышам (по меньшей мере 5 особей на опыт) внутривенно вводят по 0,01 мл суспензии угли из расчета 16 мг на 100 г веса. В течение 15 минут с интервалом в 2 минуты отбирают по 0,025 мл крови из ретроорбитального пространства. Отобранные 0,025 мл крови вносят в 2,0 мл 0,1% раствора Na 2 C0 3 . После гемолиза концентрацию угля определяют колориметрически на длине волны 675 нм при помощи калибровочных кривых.

t- время в минутах, С - концентрация углерода в пробе.

Корригированное значение фагоцитоза:

Функциональный скрининг фагоцитов

Определение дегрануляции (измерение активности (β-глюкуропидазы): 10 7 лейкоцитов суспендируют в 0,8 мл ФСБ в пластиковых пробирках, встряхивают 5 минут при 37 °С. Добавляют 0,2 мл сенсибилизированных ЛПС, флюорохромнрованных частиц (FC 80), охлаждают 30 мин на льду, центрифугируют 10 минут при 250 g. Проверяют активность фермента в надосадочной фракции. Инкубируют 0,9 мл субстратной смеси в течение 18 ч с 0,1 мл исследуемой фракции. Добавляют 2 мл 0,1М NaOH, измеряют оптическую плотность на волне 410 нм.

Расчет:

(ОП 410 х20)/(1,84х18) = число нмолей вещества, высвобождаемых за 1 час 10 7 лейкоцитами, т. е. степень дегрануляции выражают в наномолях паранитрофенил-β-глюкуронида.

Метод определения дефектов миелопероксидазы: наилучшие результаты дает биохимическое определение Н 2 0 2 , указывающее на изменения метаболизма в процессе фагоцитоза. Для практических целей весьма важно, что активация гексозо-монофосфатного шунта, восстановление тетразолиевого нитроеннего и связывание экзогенного йода с белками ПМЯЛ коррелируют с образованием Н 2 0 2 . Обычный мазок крови фиксируют 30 сек смесью алкоголь-формалин. Отмывают дистиллированной водой, и в течение 30 сек проводят окраску на пероксидазу. В содержащих пероксидазу клетках выявляются включения, окрашенные в темно-голубой цвет.

Проба на восстановление тетразолиевого нитросинего (ТНС). ТНС восстанавливается нормальными ПМЯЛ до формазана. Смешивают с 0,1 мл крови 0,1 мл 0,1% раствора ТНС в 0,15 М NaCl, инкубируют 20 минут при 37 °С, еще раз тщательно перемешивают. Включения формазана в клетки определяют микроскопией. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток.

Несколько сложнее следующий метод: 1 каплю крови пациента наносят на покровное стекло. Инкубируют 20 минут при 37°С во влажной камере, затем осторожно отмывают стекло стерильным 0,15 М NaCl. Кладут покровное стекло на предметное, куда была нанесена 1 капля ТНС-среды (0,5 мл сыворотки + 0,3 мл стерильного 0,15 М NaCl + 0,6 мл ТНС, см. ранее). Инкубируют 30 минут во влажной камере при 37 °С, удаляют покровное стекло и высушивают на воздухе. В течение 60 секунд фиксируют абсолютным метанолом и отмывают дистиллированной водой. Окрашивают в течение 5 мин сафранином (1 г сафранина + 100 мл дистиллированной воды + 40 мл глицерина), отмывают. Формазан-позитивные клетки отличаются большими размерами, они напоминают бластные клетки и содержат голубые гранулы. Обычно в препарате определяется около 30% формазан-позитивных клеток.

Вышеприведенные методы оценки фагоцитоза представляют собой обобщение очень большого числа публикаций. Более детальную информацию по этим вопросам можно найти в соответствующих работах.