Механизм фагоцитоза иммунология. Стадии фагоцитоза
Тема: « Учение об иммунитете. Неспецифические факторы защиты».
Иммунитет – это способ защиты организма от генетически чужеродных веществ – антигенов экзогенного и эндогенного происхождения, направленный на поддержание и сохранение гомеостаза, структурной и функциональной целостности организма, биологической (антигенной) индивидуальности каждого организма и вида в целом.
Такое определение подчеркивает:
что иммунология изучает способы и механизмы защиты от любых генетически чужеродных для данного организма антигенов, будут они микробного, животного или другого происхождения;
что механизмы иммунитета направлены против антигенов, которые могут проникать в организм, как из вне, так и формироваться в самом организме;
что система иммунитета направлена на сохранение и поддержание генетически детерменированной антигенной индивидуальности каждой особи, каждого вида в целом
Иммунная защита о биологической агрессии достигается триадой реакций , включающей:
распознавание чужеродных и измененных собственных макромолекул (АГ)
удаление из организма АГ и несущих их клеток.
запоминание контакта с конкретными АГ, определяющее их ускоренное удаление при повторном поступлении в организм.
Основоположники иммунологии:
Луи Пастер – принцип вакцинации.
И. И. Мечников – учение о фагоцитозе.
Пауль Эрлих – гипотеза об антителах.
О важности иммунологии как науки свидетельствует то, что авторы многих открытий отмечены Нобелевской премией.
Факторы неспецифической резистентности организма
В неспецифической защите от микробом и антигенов важную роль, как указывалось выше, играют три барьера : 1) механический, 2) физико-химический и 3) иммунобиологический. Основными защитными факторами этих барьеров являются кожа и слизистые оболочки, ферменты, фагоцитирующие клетки, комплемент, интерферон, ингибиторы сыворотки крови.
Кожа и слизистые оболочки
Многослойный эпителий здоровой кожи и слизистых оболочек обычно непроницаем для микробов и макромолекул. Однако при малозаметных микроповреждениях, воспалительных изменениях, укусах насекомых, ожогах и травмах через кожу и слизистые не могут проникать микробы и макромолекулы. Вирусы и некоторые бактерии могут проникать в макроорганизм межклеточно, через клеточно и с помощью фагоцитов, переносящих поглощенных микробов через эпителий и слизистых оболочек. Свидетельством этому является инфицирование в естественных условиях через слизистые верхних дыхательных путей, легких, желудочно-кишечного трактат урогенитального тракта, а также возможность пероральной и ингаляционной иммунизации живыми вакцинами, когда вакцинный штамм бактерий и вирусов проникает через слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей.
Физико-химическая защита
На чистой и неповрежденной коже обычно держится мало микробов, так как потовые и сальные железы постоянно выделяют на ее поверхность вещества, обладающие бактерицидным действием (уксусная, муравьиная, молочная кислоты).
Желудок также является барьером для проникающих перорально бактерий, вирусов, антигенов, так как последние инактивируются и разрушаются под влиянием кислого содержимого желудка (рН 1,5-2,5) и ферментов. В кишечнике инактивирующими факторами служат ферменты и бактериоцины, образуемые нормальной микробной флорой кишечника, а также трипсин, панкреатин, липаза, амилазы и желчь.
Иммунобиологическая защита
Фагоцитоз
Фагоцитоз (от греч. phagos - пожираю, cytos - клетка), открытый и изученный И. И. Мечниковым, является одним из основных мощных факторов, обеспечивающих резистентность организма, защиту от инородных веществ, в том числе микробов. Это наиболее древняя форма иммунной защиты, которая появилась уже у кишечнополостных.
Механизм фагоцитоза состоит в поглощении, переваривании, инактивации инородных для организма вешеств специализированными клетками - фагоцитами.
И. И. Мечников к фагоцитирующим клет кам отнес макрофаги и микрофаги. Наиболее изучены и численно преобладающие это моноциты крови и образующиеся из них макрофаги тканей. Длительность пребывания моноцитов в кровотоке составляет 2-4 сут. После этого они мигрируют в ткани, превращаясь в макрофаги. Продолжительность жизни макрофагов – от 20 сут до 7 мес (речь идет о различных субпопуляциях тканевых макрофагов); в большинстве это – 20 -40 дней.
Макрофаги крупнее моноцитов из-за распластанной формы. Макрофаги подразделяются на резидентные (стабильно локализующиеся в определенных тканях) и подвижные (мобилизуемые в очаг воспаления) В настоящее время все фагоциты объединены в единую мононуклеарную фагоцитирующую систему :
В нее включены тканевые макрофаги (альвеолярные, перитонеальные и др.), клет ки Лангерганса и Гренстейна (эпидермоциты кожи), клетки Купфера (звездчатые ретикулоэндотелиоциты), эпителиоидные клетки, нейтрофилы и эозинофилы крови и некоторые другие.
Основные функции фагоцитов .
удаляют из организма отмирающие клетки и их структуры (эритроциты, раковые клетки);
удаляют неметабилизируемые неорганические вещества, попадающие во внутреннюю среду организма тем или иным путем (например, частички угля, минеральную и другую пыль, проникающую в дыхательные пути);
поглощают и инактивируют микробы (бактерии, вирусы, грибы), их останки и продукты;
синтезируют разнообразные биологически активные вещества, необходимые для обеспечения резистентности организма (некоторые компоненты комплемента, лизоцим, интерферон, интерлейкины и др.);
участвуют в регуляции иммунной системы;
осуществляют «ознакомление» Т-хелперов с антигенами, т. е. участвуют в кооперации иммунокомпетентных клеток.
Следовательно, фагоциты являются, с одной стороны, своеобразными «мусорщиками», очищающими организм от всех инородных частиц независимо от их природы и происхождения (неспецифическая функция), а с другой стороны, участвуют в процессе специфического иммунитета путем представления антигена иммунокомпетентным клеткам (Т~ лимфоцитам) и регуляции и к активности.
Стадии фагоцитоза . Процесс фагоцитоза, т. е. поглощения инородного вещества клетками, имеет несколько стадий:
приближение фагоцита к объекту поглощения (хемотаксис);
адсорбция п оглощаемого вещества на поверхности фагоцита;
поглощение вещества путем инвагинации клеточной мембраны с образованием в протоплазме фагосомы (вакуоли, пузырьки), содержащей поглощенное вещество;
слияние фагосомы с лизосомой клетки с образованием фаголизосомы;
активация лизосомальных ферментов и переваривание вещества в фаголизосоме с их помощью.
Особенности физиологии фагоцита . Для осуществления своих функций фагоциты располагают обширным набором литических ферментов, а также продуцируют перекисные и N0" ион-радикалы, которые могут поражать мембрану (или стенку) клетки на расстоянии или после фагоцитирования. На цитоплазматической мембране находятся рецепторы к компонентам комплемента, Fc-фрагментам иммуноглобулинов, гистамину, а также антигены гистосовместимости I и II класса. Внутриклеточные лизосомы содержат до 100 различных ферментов, способных «переварить» практически любое органическое вещество.
Фагоциты имеют развитую поверхность и очень подвижны. Они способны активно перемещаться к объекту фагоцитоза по градиенту концентрации особых биологически активных веществ - хемоаттрактантов. Такое передвижение получило название хемотаксис (от греч. chymeia - искусство сплавления металлов и taxis - расположение, построение). Это АТФ-зависимый процесс, в котором участвуют сократительные белки актин и миозин. К числу хемоаттрактантов относятся, например, фрагменты компонентов комплемента (СЗа и С5а), лимфокины ИЛ-8 и др., продукты распада клеток и бактерий, плюс измененный эпителий кровеносного сосуда в месте воспаления. Как известно, ранее других клеток в очаг воспаления мигрируют нейтрофилы, существенно позже туда поступают макрофаги. Однако скорость хемотаксического перемещения одинакова. Различия связаны с разным набором факторов, служащих для них хемоаттрактантами, с более быстрой начальной реакцией нейтрофилов (запуск хемотаксиса), а также присутствие нейтрофилов в пристеночном слое сосудов (т.е. их готовность к проникновению в ткани)
Адсорбция вещества на поверхности фагоцита осуществляется за счет слабых химических взаимодействий и происходит либо спонтанно, неспецифически, либо путем связывания со специфическими рецепторами (к иммуноглобулинам, компонентам комплемента). Мембранные структуры, взаимодействующие при контакте фагоцитов с клетками мишенями (в частности, опсонины на поверхности микробной клетки и их рецепторы на поверхности фагоцита), расположены равномерно на взаимодействующих клетках. Это создает условия для последовательного обхвата частицы псевдоподиями, что тотально вовлекает в процесс всю поверхность фагоцита и приводит к поглощению частицы вследствие замыкания мембраны по принципу «застежки молнии». «Захват» фагоцитом вещества вызывает выработку большого количества перекисных радикалов («кислородный взрыв») и N0", которые вызывают необратимые, летальные повреждения как цельных клеток, так и отдельных молекул.
Поглощение адсорбированного на фагоците вещества происходит путем эндоцито за. Это энергозависимый процесс, связанный с преобразованием энергии химических связей молекулы АТФ в сократительную активность внутриклеточного актина и миозина. Окружение фагоцитируемого вещества бислойной цитоплазматической мембраной и образование изолированного внутриклеточного пузырька - фагосомы напоминает «застегивание молнии». Внутри фагосомы продолжается атака поглощенного вещества активными радикалами. После слияния фагосомы и лизосомы и образования в цитоплазме фаголизосомы происходит активация лизосомальных ферментов, которые разрушают поглощенное вещество до элементарных составляющих, пригодных для дальнейшей утилизации для нужд самого фагоцита.
В фаголизосоме существует несколько систем факторов бактерицидности :
факторы, требующие участия кислорода
азотистые метаболиты
активные субстанции, в том числе и ферменты
локальное закисление.
Одной из основных форм разрушения микроорганизма внутри макрофага – это кислородный взрыв . Кислородный, или дыхательный взрыв – это процесс образования продуктов частично восстановленного кислорода, свободных радикалов, перекисей и других продуктов, обладающих высокой антимикробной активностью. Эти процессы развиваются в течение секунд, что и определило их обозначение как «взрыв». Обнаружены различия между КВ нейтрофилов и макрофагов , в первом случаи реакция более кратковременная, но интенсивнее, она приводит к большому накоплению перекиси водорода и не зависит от синтеза белков, во втором случаи она более длительная, но подавляется ингибитором синтеза белка циклогексидином.
Окись азота и радикал NO (особенно важно при разрушении микобактерий).
Ферментативное расщепление вещества может также происходить внеклеточно при выходе ферментов за пределы фагоцита.
Затрудняется поступление в микробную клетку питательных веществ в следствии снижения ее электронного потенциала. В кислой среде повышается активность ферментов.
Фагоциты, как правило, «переваривают» захваченные бактерии, грибы, вирусы, осуществляя таким образом завершенный фагоцитоз. Однако в ряде случаев фагоцитоз носит незавершенный характер : поглощенные бактерии (например, иерсинии) или вирусы (например, возбудитель ВИЧ-инфекции, натуральной оспы) блокируют ферментативную активность фагоцита, не погибают, не разрушаются и даже размножаются в фагоцитах. Такой процесс получил название незавершенный фагоцитоз.
Небольшой олигопептид может быть эндоцитирован фагоцитом и после процессинга (т. е. ограниченного протеолиза) включен в состав молекулы антигена гистосовметимо ти II класса. В составе сложного макромолекулярного комплекса олигопептид выставляется (экспрессируется) на поверхности клетки для «ознакомления» с ним Т-хелперов.
Фагоцитоз активируется под влиянием антител-опсонинов, адъювантами, комплементом, иммуноцитокинами (ИЛ-2) и другими факторами. Механизм активирующего действия опсонинов основан на связывании комплекса антиген-антитело с рецепторами к Fc-фрагментам иммуноглобулинов на поверхности фагоцитов. Аналогичным образом действует комплемент, который способствует связыванию на специфических для него рецепторах фагоцита (С-рецепторах) комплекса антиген-антитело. Адъюванты укрупняют молекулы антигена и таким образом облегчают процесс его поглощения, так как интенсивность фагоцитоза зависит от величины поглощаемой частицы.
Активность фагоцитов характеризуется фа гоцитарными показателями и опсоно-фагоци тарным индексом.
Фагоцитарные показатели оцениваются числом бактерий, поглощенных или «переваренных» одним фагоцитом в единицу времени, а опсонофагоцитарный индекс представляет отношение фагоцитарных показателей, полученных с иммунной, т. е. содержащей опсонины, и неиммунной сывороткой. Эти показатели используются в клинической практике для определения иммунного статуса индивидуума.
Секреторная активность макрофагов. Т акая активность свойственна преимущественно активированным фагоцитирующим клеткам, но по крайней мере макрофаги выделяют субстанции (лизоцим, простагландин Е2) спонтанно. Активность выражается в двух формах :
1 . выброс содержимого гранул (для макрофагов лизосом), т.е. дегрануляция .
2 . секреция с участием ЭПР и аппарата Гольджи.
Дегрануляция свойственна всем основным фагоцитирующим клеткам, а второй тип исключительно макрофагам.
С остав гранул нейтрофилов разделен на две части, одни действуют при нейтральных или щелочных значения ph, другая кислые гидролазы.
Главная особенность макрофагов в сравнение с нейтрофилами, это значительно более выраженная секреция, не связанная с дегрануляцией.
Макрофаги спонтанно секретируют : лизоцим, компаненты комплимента, ряд ферментов (например, эластазу), фибронектин, апопротеин А и липопротеиновую липазу. При активизации значительно увеличивается секреция: С2, С4, фибронектина, активатора плазминогена, включается синтез цитокинов (ИЛ1, 6 и 8), ФНОα, интерферонов α, β, гормонов и др.
Активация макрофагов приводит к процессам дегрануляции фагосом и лизосом с выделение продуктов, аналогичных тем, которые выделяются при дегрануляции нейтрофилов. Комплекс этих продуктов обуславливает внеклеточный бактериолиз и цитолиз, а так же переваривание компонентов разрушенных клеток. Однако внеклеточная бактерицидная активность у макрофагов выражена слабее, чем у нейтрофилов . Макрофаги не вызывают массированного аутолиза, приводящего к формированию гноя.
Фагоцитоз - особый процесс поглощения клеткой крупных макромолекулярных комплексов или корпускулярных структур. «Профессиональные» фагоциты у млекопитающих - два типа дифференцированных клеток - нейтрофилы и макрофаги, которые созревают в костном мозгу из СКК и имеют общую промежуточную клетку-предшественника.Нейтрофилы циркулируют в периферической крови и составляют значительную часть лейкоцитов крови - 60-70%, или 2,5-7,5x109 клеток в 1 л крови. В норме нейтрофилы не выходят из сосудов в периферические ткани, но они первыми «бросаются» (т.е. подвергаются экстравазации) в очаг воспаления за счёт быстрой экспрессии молекул адгезии - VCAM-1 (лиганд на эндотелии VLA-4) и интегрина CDllb/CD18 (лиганд на эндотелии ICAM-1). На их наружной мембране идентифицированы эксклюзивные маркёры - CD66a и CD66d (раковоэмбриональные Аг).
Моноциты и макрофаги. Моноциты являются «промежуточной формой», в крови их 5-10% от общего числа лейкоцитов. Их предназначение - стать и быть оседлыми макрофагами в тканях.
Макрофаги печени - купферовские клетки, мозга - микроглия, макрофаги лёгких - альвеолярные и интерстициальные, почек - мезангиальные.
♦ Рецепторы мембраны макрофагов.
О CD115 - Рц для колониестимулирующего фактора моноцитов (M-CSF). Присутствует также на мембране полипотентной клетки-предшественника гранулоцитов и моноцитов и унипотентного предшественника моноцитов, о Известно 4 структуры - Рц на клеточной мембране макрофагов, связывающих то, что макрофаг потенциально способен поглотить по механизму фагоцитоза
CD14 - Рц для комплексов бактериальных ЛПС со связывающими липополисахариды белками сыворотки (LBP), а также комплексов ЛПС с другими микробными продуктами (например, с эндотоксинами).- Рц для связывания фрагментов фосфолипидных мембран и других компонентов собственных повреждённых и умирающих клеток (Рц для «мусора», scavenger receptors). Таков, например, CD 163 - Рц для «старых» эритроцитов. Рц, связывающий маннозу. Присутствует только на мембране тканевых макрофагов.
- Рц для комплемента - CR3 (интегрин CDllb/CD18) и CR4 (интегрин CDllc/CD18). Помимо комплемента, они связывают и ряд бактериальных продуктов: липополисахариды, липофосфогликан Leishmania, гемагглютинин из филаментов Bordetella, поверхностные структуры дрожжевых клеток родов Candida и Histoplasma.
CD64 - Рц для «хвостов» (Fc-фрагментов) IgG - FcyRI (Fcy-Рц первого типа), обеспечивающие возможность фагоцитоза макрофагами иммунных комплексов. Считаются мембранными маркёрами моноцитов/макрофагов, поскольку экспрессируются только на этих клетках. Подклассы IgG по силе связи с FcyRI располагаются в следующем порядке: IgG3 >IgGl >IgG4 >IgG2. о Рецепторы, осуществляющие взаимодействие с лимфоцитарным иммунитетом. Наряду с уже упомянутым CD64, к ним относят: - Рц для цитокинов, вырабатываемых иммунными лимфоцитами. Связывание с лигандами Рц для ИФНу и для фактора некроза опухоли (TNF) ведёт к активации макрофага. Через Рц для ИЛ-10 макрофаг, напротив, инактивируется. - CD40, В7, МНС-I/II - мембранные молекулы для контактов с комплементарными мембранными молекулами лимфоцитов, т.е.
для непосредственных межклеточных взаимодействий. У нейтрофилов таких рецепторов нет. Последствия фагоцитоза. После того, как фагоцит обхватывает своей мембраной поглощаемый объект и заключает его в мембранную везикулу, называемую фагосомой, происходят следующие события.
♦ Расщепление фагоцитированного материала. Этот процесс идёт по одинаковым биохимическим механизмам во всех фагоцитах, о Лизосомы - специальные внутриклеточные органеллы, содержащие набор гидролитических ферментов (кислых протеаз и гидролаз) с оптимумом рН примерно 4,0. В клетке лизосомы сливаются с фагосомами в фаголизосому, где и происходят реакции расщепления поглощённого материала.о Ферментные системы: НАДФ-Н-оксидазы, супероксиддисмутаза, NO-синтазы, которые генерируют активные формы неорганических окислителей, - пероксид водорода (Н202), супероксид анион (02-), синглетный кислород (1O2), радикал гидроксила (ОН-), гипохлорид (ОС1-), оксид азота (NO+). Эти радикалы также участвуют в деструкции фагоцитированного объекта.
♦ Секреция литических ферментов и окислительных радикалов в межклеточное пространство, где они также оказывают бактерицидное действие (но при этом поражают и собственные ткани).
Нейтрофилы, помимо уже названных веществ, продуцируют и секретируют коллагеназу, катепсин G, желатиназу, эластазу и фосфолипазу А2.
♦ Продукция и секреция цитокинов. Макрофаги и нейтрофилы, активированные микробными продуктами, начинают продуцировать цитокины и другие биологически активные медиаторы, создающие в очаге внедрения внешних субстанций доиммунное воспаление, которое подготавливает возможность развития лимфоцитарного иммунного ответа.
О Макрофаги продуцируют интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12); фактор некроза опухоли a (TNFa); простагландины; лейкотриен В4 (LTB4); фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ).
о Нейтрофилы продуцируют TNFa, ИЛ-12, хемокин ИЛ-8, ЬТВ4 и ФАТ.
♦ Процессинг и представление Аг - образование внутри клеток комплексов из продуктов расщепления фагоцитированного материала с собственными молекулами МНС-II и экспрессия этого комплекса на поверхность клетки с «целью» представления Аг для распознавания Т-лимфоцитами. Этот процесс осуществляется только макрофагами.
Фагоцитоз филогенетически является наиболее древним защитным процессом, осуществляемым специализированными клетками иммунной системы (Мечников 1883, 1892; Greenberg, 1999). Именно И. И. Мечниковым впервые в сравнительных морфофизиологических исследованиях была доказана ключевая роль этого механизма иммунной защиты в формировании резистентности животных к инфекции.
К профессиональным фагоцитам у позвоночных животных в первую очередь относятся нейтрофилы (полиморфноядерные лейкоциты, микрофаги) и моноциты/макрофаги (моноядерные, мононуклеарные фагоциты). Эти клетки морфофизиологически и биохимически приспособлены к осуществлению поглощения и инактивации микробных тел и частиц, превышающих размеры диаметром 0.5 мкм (размер наименьших бактерий группы Mycoplasma). Отличие фагоцитоза от других форм эндоцитарных реакций клеток предполагает обязательное участие в этом процессе актинового цитоскелета, который в форме микрофиламентов пронизывает псевдоподии, осуществляющие захват микроорганизмов и частиц. Фагоцитоз требует для своего протекания определенных температурных условуй (t > +13-18 °С) и не происходит при более низких температурах у позвоночных животных. Наряду с нейтрофилами и моноцитами/макрофагами в фагоцитозе принимают участие незрелые дендритные клетки, эозинофилы, тучные клетки, эпителиальные клетки, тромбоциты и даже некоторые лимфоциты.
Контакт фагоцита с микроорганизмом инициирует клеточные реакции, связанные с цитоплазматической мембраной, цитоскелетом, активацией механизмов убивания (киллинга) патогенов, продукцией цитокинов, хемокинов и молекул, играющих ключевую роль в представлении антигенов (Underhill, Ozinsky, 2002).
Рецепторы фагоцитоза
|
Клетки | Рецептор | Мишень | Лиганд |
Макрофаги | MARCO | Е. co/і, S. aureus | Неидентифи- |
» | MER | Апоптические тимоциты | ? Gas6Apoc- фатидил- серин |
Многие | PSR | Апоптические | Фосфати- дилсерин |
Макрофаги | CD36 | Апоптические нейтрофилы | Фосфати- дилсерин |
» | CD14 | Pseudomonas апоптические | ?лпс неиденти- фицирован |
Многие | pi-интегрины | Yersinia spp. | Инвазии |
клетки | |||
Макрофаги | опфЗ | Апоптические | ? тромбоспондин |
Дендритные | софЗ | То же | Неиденти- |
альные | |||
Эпителиаль- | Е-кадхерин | Listeria spp. | 1п1А |
ные клетки | |||
То же | Met | То же | 1п1В |
Основные стадии фагоцитоза: хемотаксис, контакт фагоцита с микробом, поглощение (интернализация) микроорганизмов (фагоцитоз в узком смысле слова), инактивация (киллинг) и последующее переваривание патогенов в вакуолярном аппарате фагоцитов (завершение фагоцитоза). Наряду с этими функциональными проявлениями фагоцитоз, как правило, сопровождается секреторными реакциями фагоцитов, особенно моноцитов/ макрофагов и дендритных клеток, в ходе которых выделяются разнообразные физиологически активные вещества, обеспечивающие протективный характер течения и завершения всего процесса в целом.
В распознавании, контакте и поглощении микробов фагоцитами участвуют разнообразные рецепторы (табл. 7) (Greenberg, 78
Grinstein, 2002). С помощью современных молекулярно-генетических методов установлено, что при фагоцитозе частиц латекса макрофагами мыши в фагоцитах наблюдаются изменения в экспрессии более 200 генов, а при фагоцитозе Mycobacterium tuberculosis - около 600 (Ehrt et al., 2001). Все это свидетельствует о сложном и комплексном характере структурно-функциональных изменений в макрофагах, сопряженных с фагоцитарным процессом. Понимание их молекулярной основы обеспечит в перспективе создание фармакологических средств, направленно регулирующих процесс фагоцитоза. Многообразие рецепторов обеспечивает эффективность распознавания патогенов («несвоего») и является необходимым условием для последующей прицельной инактивации инфекционных агентов. В одной из современных концепций врожденного иммунитета совокупность этих рецепторов принято обозначать как систему рецепторов (молекул), распознающих патогенассоциированные молекулярные паттерны (Janeway, 1992, 2002). "
Фагоцитоз (от греч. phago – пожираю и cytos – клетка) представляет собой процесс поглощения и переваривания антигенных веществ, в том числе микроорганизмов, клетками мезодермального происхождения, названными фагоцитами . И. И. Мечников разделил фагоциты на макрофаги и микрофаги . В настоящее время макро- и микрофаги объединены в единую систему макрофагов (СМФ) . К этой системе относят:
- тканевые макрофаги – эпителиоидные клетки,
- звездчатые ретикулоэндотелиоциты (клетки Купфера),
- альвеолярные и перитонеальные макрофаги, находящиеся в альвеолах и полости брюшины,
- белые отросчатые эпидермоциты кожи (клетки Лангерганса) и др.
К микрофагам относятся:
- нейтрофилы,
- эозинофилы,
- базофилы.
Функции макрофагов чрезвычайно разнообразны. Они первые реагируют на чужеродное вещество, являясь специализированными клетками, поглощающими и уничтожающими в организме чужеродные субстанции (отмирающие клетки, раковые клетки, бактерии, вирусы и другие микроорганизмы, антигены, неметаболизируемые неорганические вещества). Кроме того, макрофаги вырабатывают многие биологически активные вещества – ферменты (в том числе лизоцим, пероксидазу, эстеразу), белки комплемента, иммуномодуляторы типа интерлейкинов. Наличие на поверхности макрофагов рецепторов к иммуноглобулинам (Am) и комплементу, а также система медиаторов обеспечивает их взаимодействие с Т- и В- лимфоцитами. При этом макрофаги активируют защитные функции Т-лимфоцитов. Благодаря наличию рецепторов к комплементу и Am, а также Аг системы гистосовместимости (HLA) макрофаги принимают участие в связывании и распознавании антигенов. Таким образом, фагоцитам присущи три функции:
- защитная, связанная с очисткой организма от инфекционных агентов, продуктов распада тканей и т. д.;
- представляющая, заключающаяся в презентации лимфоцитам антигенных эпитолов на мембране фагоцита;
- секреторная, связанная с секрецией лизосомных ферментов и других биологически активных веществ – цитокинов, играющих важную роль в иммуногенезе.
Различают следующие последовательно протекающие стадии фагоцитоза .
- Хемотаксис – целенаправленное передвижение фагоцитов в направлении химического градиента хемоаттрактантов в окружающей среде. Способность к хемотаксису связана с наличием на мембране специфических рецепторов для хемоаттрактантов (объектов фагоцитоза), в качестве которых могут выступать бактерии, продукты деградации тканей организма и др.
- Адгезия (прикрепление) также опосредована соответствующими рецепторами, но может протекать в соответствии с законами неспецифического физико-химического взаимодействия. Происходит адсорбция частиц на поверхности макрофага.
- Эндоцитоз (захват) – происходит инвагинация клеточной мембраны, захват чужеродной частицы и погружение ее в протоплазму. В результате эндоцитоза образуется фагоцитарная вакуоль – фагосома (т. е. пузырек в протоплазме вокруг поглощенной частицы).
- Внутриклеточное переваривание – начинается по мере поглощения фагоцитируемых объектов. Происходит слияние фагосомы с лизосомой фагоцита, содержащей десятки ферментов, и образование фаголизосомы (деструкция) захваченной частицы ферментами. При поглощении частицы, принадлежащей самому организму (например, погибшая клетка или ее части, собственные белки), происходит расщепление ее ферментами фаголизосомы до неантигенных веществ (аминокислоты, жирные кислоты, нуклеотиды, моносахара). Если поглощается чужеродная частица, то ферменты фаголизосомы не в состоянии расщепить вещество до неантигенных компонентов. В таких случаях фаголизосома с оставшейся и сохранившей чужеродность частью антигена передается макрофагом Т- и В-лимфоцитам, т. е. включается специфическое звено иммунитета.
Секреторная функция заключается в секреции фагоцитами биологически активных веществ – цитокинов – это интерлейкин-1 и интерлейкин-2, которые являются клеточными медиаторами, оказывающими регулирующее действие на пролиферацию, дифференциацию и функции фагоцитов, лимфоцитов, лимфобластов и других клеток. Макрофаги продуцируют и секретируют такие важные регуляторные факторы, как простагландины, лейкотриены, циклические нуклеотиды с широким спектром биологической активности. Кроме того, макрофаги синтезируют и секретируют ряд продуктов, обладающих антибактериальной, антивирусной и цитотоксической активностью (кислородные радикалы О2- Н2О2, лизоцим, интерферон и др.).
Фагоцитоз усиливается антителами-опсонинами, так как связанный или антиген легче адсорбируется на поверхности фагоцита, вследствие наличия у последнего рецепторов к этим антителам. Такое усиление фагоцитоза антителами названо опсонизацией , т.е. подготовкой микроорганизмов к захвату фагоцитами. Фагоцитоз опсонизированых антигенов называют иммунным .
Для характеристики активности фагоцитоза введен фагоцитарный показатель. Для определения его подсчитывают под микроскопом число бактерий, поглощенных одним фагоцитом. Пользуются также опсонофагоцитарным индексом , представляющим отношение фагоцитарных показателей, полученных с иммунной и не иммунной сывороткой. Фагоцитарный показатель и опсонофагоцитарный индекс используют в клинической иммунологии для оценки состояния иммунитета и иммунного статуса.
Фагоцитоз играет большую роль в противобактериальной, противогрибковой и противовирусной защите, поддержании резистентности организма к чужеродным веществам. Фагоциты также оказывают активирующее и супрессивное действие на лимфоциты, принимают участие в реанимации иммунологической толерантности, антиинфекционного, трансплантационного и противоопухолевого иммунитета, некоторых форм аллергии (ГЗТ).
В литературе описано большое число методов количественной оценки фагоцитоза. Объем настоящей книги не позволяет подробно изложить все из них, поэтому мы ограничимся описанием лишь некоторых.
Материалы и оборудование
Для работы необходимо иметь:
Цитратдекстрозный антикоагулянт: 8 г лимонной кислоты,. 22 г трехзамещенного цитрата натрия (двухводного), 24,5 г глюкозы растворяют в 1 л воды;
Раствор декстрозодекстрана: 4,5 г NaCl, 25 г глюкозы, 30 г декстрана (отн. мол. масса 500 000) в 1 л;
Раствор хлористого аммония: 9 частей 0,83% хлористого аммония, 1 часть трис-НСl-буфера с рН 7,2 (20,6 г/л);
Смесь фиколл - визотраст: 9 г фиколла, 20 мл визотраста, 100 мл бидистиллированной Н 2 0, плотность 1,077;
Субстрат для β-глюкуронидазы: 31,5 мг паранитрофенил-β-глюкуронида и 100 мкм тритон X 100 растворяют в 100 мл 0,05 М натрий-ацетатного буфера с рН 5;
Реагенты для определения дефицита миелопероксидазы: фиксатор (10 мл 37% формальдегида с 90 мл абсолютного этанола), субстратный раствор (100 мл 30% ЭДТА, 0,3 г хлористого бензидина, 0,038 г ZnS0 4 x7H 2 0, 1 мл дистиллированной воды, 1,0 г CH 3 C00Nax3H 2 0, 0,7 мл 3% Н 2 0 2); подводят рН 1,0 М NaOH до 6,0.
Коммерческие реагенты:
ФСБ, раствор Хенкса и среда Игла-MEM (Гос. институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин-Вайсензее, ГДР);
Гепарин (5000 ЕД/мг) (Gedeon Richter, Венгрия);
Сыворотка эмбрионов коров (Flow Laboratories, США, можно другой фирмы);
Визотраст (VEB Fahlberg List, Magdeburg, ГДР);
Инфуколл (VEB Serumwerk Bernburg, ГДР);
Декстран, фиколл (Pharmacia, Швеция);
Коллоидный уголь Сl1/143a (Wagner, Pelikanwerke, ФРГ);
Диизодецилфталат, парадиоксан (Coleman, Matheson and Bell, США);
Тритон X 100 (Serva, ФРГ, можно другой фирмы);
Масляный красный О (Allied chemical corp., Morristown, NY, США);
Иаранитрофенил-β-глюкуронид (Sigma, США);
Сафранин О (Fischer Scientific Lab., Chicago, США);
Полистироловые бусы, трубочки (Nunc, Дания);
Сетка F 905 (VEB Orvo Wolfen, ГДР).
Получение фагоцитов
Необходимые сведения о выделении гранулоцитов человека можно получить в главе "Разделение клеток иммунной системы "; получение перитонеальных макрофагов см. в разделах "Культивирование макрофагов и моноцитов " и "Выделение макрофагов из суспензии сплеиоцитов ". Детально этот вопрос рассматривается в ряде работ.
Кроме того следует еще упомянуть о следующих методах:
8 мл крови смешивают с раствором декстранглюкозы. Затем добавляют 6% раствор декстрана 75 в 0,15 М NaCl (5 мл). Смесь оставляют на 45-50 мин при комнатной температуре для седиментации эритроцитов. Отсасывают плазму. Остаточные эритроциты лизируют добавлением 0,83% хлористого аммония (35 мл к 15 мл плазмы). Центрифугируют 10 минут при 80g, суспендируют осадок в охлажденном до 0°С 0,15 М NaCl. Объединяют несколько осадков и центрифугируют 10 минут при 800 g. Клетки лучше сохранять на льду в 0,15 М NaCl (эта среда больше подходит, чем забуференные среды с бивалентными катионами, которые вызывают слипание клеток);
Если объектом фагоцитоза являются дрожжи, можно опустить стадию обработки хлористым аммонием, так как эритроциты не мешают процессу. Мононуклеары можно получать следующим образом: гепаринизированную кровь смешивают с 1 / 3 объема среды Игла, содержащей 15% глюкозы, наслаивают на слой смеси фиколл - визотраст и центрифугируют 20 мин при 400 g. Фракцию мононуклеаров отсасывают пастеровской пипеткой, дважды отмывают ФСБ и готовят суспензию на среде Игла (1х10 7 клеток/мл).
Приготовление частиц для фагоцитоза
Чаще используют живые культуры Staphylococcus aureus (SG 511 или 502 A), Staphylococcus epididermidis SG 475, E. coli и другие энтеробактерии, листерии, коринебактерии, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. Микроорганизмы выращивают 24 часа (при необходимости 48 ч) на твердых и жидких питательных средах. Собранную биомассу трижды отмывают 0,15М NaCl. Слишком густую взвесь измеряют при 640 нм, определяют концентрацию по калибровочной кривой.
Концентрацию микроорганизмов определяют также методами рассева на плотные питательные среды; в некоторых случаях подсчет микроорганизмов можно проводить в счетных камерах.
При работе с живыми бактериальными культурами следует обращать внимание на то, чтобы использовались всегда культуры на одной и той же стадии. Добавление 0,01%бычьий сывороточный альбуминспособствует выживаемости микроорганизмов. Изготовленная суспензия остается стабильной в течение 1-2 ч.
Убитые культуры микроорганизмов обычно получают нагреванием в течение 30 минут при 80 °С или обработкой текучим паром. Убитые микробы трижды отмывают 0,15 М NaCl, ресуспендируют и определяют концентрацию суспензии.
Приготовление пекарских дрожжей: 0,5 г пекарских дрожжей суспендируют в 0,15 М NaCl и помещают на 30 мин в кипящую водяную баню. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. При использовании живых дрожжей свежие клетки (4-5-дневная культура) трижды отмывают в среде Игла с добавлением 1,0% глюкозы. Обычно используют суспензию клеток 10 8 и 10 9 клеток/мл. Дрожжи используют в качестве тест-частиц при выявлении дефектов компонента С5.
Использование взвеси частиц полистирола: готовят 10% водную суспензию частиц полистирола диаметром 1,091 мкм. Разводят ее в соотношении 1 + 1 0,2% раствором БСА в 0,15 М NaCl, центрифугируют. При длине волны 253 нм суспензия полистирола 1 мкг/мл дает поглощение 1,17х10 -3 .
Применение суспензии липополисахарид - масляный красный О в минеральном масле: 2 г масляного красного растирают в 50 мл диизодецилфталата (или вазелиновое масло) в фарфоровой ступке. Центрифугируют 20 мин при 500 g. Добавляют 10 мкг надосадочной фракции к 10 мл диоксина, измеряют оптическую плотность на длине волны 525 им. Фактор пересчета равен 0,92. На втором этапе 40 мг липополисахарид (Е. coli 0,26 В6 и др.) растворяют в 3 мл 0,15 М NaCl. Затем добавляют к этой смеси 1 мл раствора масляного красного О в диизодецилсульфате, суспендируют смесь в течение 90 секунд. Суспензию используют немедленно, ее можно замораживать.
Для постановки реакции фагоцитоза в качестве тест-частиц можно использовать формалинизированные эритроциты.
Фагоцитоз бактерий, бактерицидность
Эксперимент с суспензией живых бактерий: обычно используют соотношение 3-10 микробов/фагоцит. В общем объеме 2 мл смешивают 1x10 6 фагацитов с 3х10 6 - 1х10 7 микробов. На практике к 1 мл суспензии фагоцитов, к которому было добавлено 8 ME гепарина, приливают 1 мл суспензии бактерий. Время взаимодействия составляет обычно 30 мин, в некоторых случаях оно больше. После инкубации отбирают 0,5 мл смеси, добавляют 1,5 мл 0,1% раствора желатина в растворе Хенкса, охлажденного до 0°С, и центрифугируют 3-4 мин при 300 g. Из осадка готовят мазки, которые окрашивают по Паппенгейму. Просматривают 200 клеток (по возможности трижды). Вычисляют процент фагоцитоза. По числу содержащихся в клетках бактерий рассчитывают индекс активности фагоцитоза: число фагоцитированных бактерий умножают на процент фагоцитирующих клеток; интенсивность фагоцитоза выражают числами от 1 до 4.
Степень 1: фагоцитировано I-4 бактерий
Степень 2: фагоцитировано 5-7 бактерий
Степень 3: фагоцитировано 8-10 бактерий
Степень 4: фагоцитировано более 10 бактерий на клетку
При определении уровня фагоцитоза живых микробов отдельно проверяют осадок клеток и надосадочную фракцию. Количество живых микробов определяют по рассеву на плотные питательные среды 0,1 мл исследуемых фракций. Инкубируют 24 (48) ч. При расчете бактерицидности исходят из того, что одна образовавшаяся колония соответствует одному живому микробу.
Для направленного изучения бактерицидности исследуют кровь пациентов и здоровых доноров с добавлением раствора антибиотиков (по 5000 ЕД пенициллина и стрептомицина/мл) и без него, а также проводят бактериальный контроль. Состав пробы: 0,3 мл раствора Хенкса+ 0,1 мл нормальной сыворотки, полученной из крови, взятой у 5 доноров, +0,5 мл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) +0,1 мл суспензии микробов (10 6 микробов/мл). Раствор антибиотиков вносят по 0,02 мл в пробу. Инкубируют пробы при 37 °С и определяют число микробов через 20 минут, 1,5 часа и 3 часа. Для этого отбирают по 0,1 мл из каждой пробы, разводят отобранные аликвоты раствором Хенкса в 10, 100 и 1000 раз и наносят на подогретый агар. Иногда, особенно если были добавлены антибиотики, для точного подсчета микробов готовят промежуточные разведения (например, 0,2 мл пробы смешивают с 5 мл раствора Хенкса, центрифугируют 5 минут при 450 g, осадок растворяют в 1,9 мл ФСБ, наносят на агар). Если хотят сократить длительность бактериологического исследования, можно определять находящиеся внутри клетки микробы по флюоресценции при помощи окраски акридиновым желтым.
Фагоцитоз пекарских дрожжей: готовят суспензию 10 9 клеток/мл в 0,15 М NaCl. Смешивают 0,1 мл суспензии с 0,1 мл плазмы больного, инкубируют 30 мин при 37 °С, добавляют 0,2 мл (10 6) ПМЯЛ, инкубируют 30 мин. Отбирают аликвоты через интервалы от 5 до 30 мин. Просчитывают 100 ПМЯЛ и определяют число захваченных дрожжевых частиц на клетку. Известна следующая модификация: к 50 мкл сыворотки морской свинки добавляют 50 мкл исследуемой сыворотки (предварительно ее разводят в соотношении 1 + 1 средой Игла с глюкозой), добавляют 50-200 мкл суспензии лейкоцитов (10 7 клеток/мл) доводят объем до 450 мкл средой Игла с глюкозой и инкубируют 30 мин при 37 °С. Затем добавляют 50 мкл суспензии дрожжей (10 8 клеток/мл) перемешивают, инкубируют 40 минут при 37 °С. Вносят 50 мкл L- 75 Sе-метионина (общая активность 100 кБк) перемешивают и инкубируют 1 час при 37 °С. Осаждают клетки центрифугированием в течение 5 минут при 1000 g, отмывают их дважды ФСБ, измеряют радиоактивность на гамме-счетчике. Процент фагоцитированных дрожжей вычисляют по формуле:
Фагоцитоз с использованием раствора масляного красного в минеральном масле: 0,2 мл суспензии частиц смешивают с 0,8 мл клеточной суспензии, предварительно нагретой до 37°С. Через 5 минут инкубации добавляют 6 мл охлажденного до 0°С 0,15 М раствора NaCl, содержащего 126 мкг/кл N-этилмалеимида (для прекращения захвата частиц). Центрифугируют 10 минут при 250 g. Надосадочную фракцию отбрасывают, осадок ресуспендируют в растворе NaCl и N-этилмалеимида (см. выше), дважды отмывают клетки. Лизируют клетки ультразвуком, происходит высвобождение масляного красного. Добавляют 1 мл диоксана. Центрифугируют 15 минут при 500 g, измеряют оптическую плотность на волне 525 нм против чистого диоксана. Степень фагоцитоза (ИФ) определяют как количество минерального масла (мг), поглощаемого в минуту 10 7 клетками. Для подсчета можно использовать следующую формулу:
Исследование фагоцитоза в монослое макрофагов:
1. Фаза: в стерильные полистирольные пробирки вносят по 2 мл суспензии клеток (200 000 клеток/мл). Инокулируют 5 часов при 37°С, затем отмывают средой Игла. Вносят в пробирки 2 мл культуральной среды с 10% инактивированной (30 мин, 56 °С) сыворотки эмбрионов коров, инкубируют при 37 °С.
2. Фаза А: вносят суспензию микробов (3-10/макрофаг), инкубируют 30-60 мин при 37 °С, 6 раз ополаскивают пробирки порциями среды по 3 мл для удаления нефагоцитированных микробов. Немедленно фиксируют препарат смесью 1 части ледяной уксусной кислоты с 3 частями метанола. Окрашивают препарат по May - Griinwald, подсчитывают клетки.
Фаза Б: определение внутриклеточных живых бактерий. Последовательность операций та же, что и в фазе А до этапа фиксации. После отмывки тщательно удаляют все следы среды. Лизируют клетки, для чего вносят 2 мл 0,01% стерильного растворабычьий сывороточный альбумин(4°С), многократно встряхивают. Большая часть клеток лизируется через 20 минут. Высвободившиеся бактерии определяют путем рассева на плотные питательные среды.
Фагоцитоз эритроцитов: смешивают 4x10 7 фагоцитов с 5x10 7 тест-эритроцитов в 5 мл ФСБ. Переносят 2 мл смеси в охлажденный до 0°С 5 мМ фосфатный буфер и центрифугируют. Измеряют оптическую плотность надосадочной фракции при длине волны 420 нм. Степень фагоцитоза определяют по снижению содержания гемоглобина в бесклеточной фазе при помощи калибровочных кривых.
Упрощенный метод определения клиренса
Пример определения клиренса на крысах: животным вводят внутрибрюшиино по 5х10 7 микробов на 100 г веса (0,1мл/ /100 г). Оптимальная доза может колебаться от 10 6 до 10 8 на 100 г веса. С интервалом 1-2 часа из каждой группы экспериментальных животных забивают по 3 особи; общая продолжительность эксперимента 16 часив. Стерильно берут 0,5 мл крови из сердца, 1 мл перитонеальной жидкости, выделяют легкие, печень, селезенку и почки. Из ткани органов вырезают цилиндры пастеровской пипеткой. Определяют число микроорганизмов путем культивирования на жидких и твердых питательных средах.
Пример определения клиренса на мышах: используют коллоидный уголь или меченные 51 [Сг] эритроциты барана. Мышам (по меньшей мере 5 особей на опыт) внутривенно вводят по 0,01 мл суспензии угли из расчета 16 мг на 100 г веса. В течение 15 минут с интервалом в 2 минуты отбирают по 0,025 мл крови из ретроорбитального пространства. Отобранные 0,025 мл крови вносят в 2,0 мл 0,1% раствора Na 2 C0 3 . После гемолиза концентрацию угля определяют колориметрически на длине волны 675 нм при помощи калибровочных кривых.
t- время в минутах, С - концентрация углерода в пробе.
Корригированное значение фагоцитоза:
Функциональный скрининг фагоцитов
Определение дегрануляции (измерение активности (β-глюкуропидазы): 10 7 лейкоцитов суспендируют в 0,8 мл ФСБ в пластиковых пробирках, встряхивают 5 минут при 37 °С. Добавляют 0,2 мл сенсибилизированных ЛПС, флюорохромнрованных частиц (FC 80), охлаждают 30 мин на льду, центрифугируют 10 минут при 250 g. Проверяют активность фермента в надосадочной фракции. Инкубируют 0,9 мл субстратной смеси в течение 18 ч с 0,1 мл исследуемой фракции. Добавляют 2 мл 0,1М NaOH, измеряют оптическую плотность на волне 410 нм.
Расчет:
(ОП 410 х20)/(1,84х18) = число нмолей вещества, высвобождаемых за 1 час 10 7 лейкоцитами, т. е. степень дегрануляции выражают в наномолях паранитрофенил-β-глюкуронида.
Метод определения дефектов миелопероксидазы: наилучшие результаты дает биохимическое определение Н 2 0 2 , указывающее на изменения метаболизма в процессе фагоцитоза. Для практических целей весьма важно, что активация гексозо-монофосфатного шунта, восстановление тетразолиевого нитроеннего и связывание экзогенного йода с белками ПМЯЛ коррелируют с образованием Н 2 0 2 . Обычный мазок крови фиксируют 30 сек смесью алкоголь-формалин. Отмывают дистиллированной водой, и в течение 30 сек проводят окраску на пероксидазу. В содержащих пероксидазу клетках выявляются включения, окрашенные в темно-голубой цвет.
Проба на восстановление тетразолиевого нитросинего (ТНС). ТНС восстанавливается нормальными ПМЯЛ до формазана. Смешивают с 0,1 мл крови 0,1 мл 0,1% раствора ТНС в 0,15 М NaCl, инкубируют 20 минут при 37 °С, еще раз тщательно перемешивают. Включения формазана в клетки определяют микроскопией. Результат выражают в процентах формазан-позитивных клеток.
Несколько сложнее следующий метод: 1 каплю крови пациента наносят на покровное стекло. Инкубируют 20 минут при 37°С во влажной камере, затем осторожно отмывают стекло стерильным 0,15 М NaCl. Кладут покровное стекло на предметное, куда была нанесена 1 капля ТНС-среды (0,5 мл сыворотки + 0,3 мл стерильного 0,15 М NaCl + 0,6 мл ТНС, см. ранее). Инкубируют 30 минут во влажной камере при 37 °С, удаляют покровное стекло и высушивают на воздухе. В течение 60 секунд фиксируют абсолютным метанолом и отмывают дистиллированной водой. Окрашивают в течение 5 мин сафранином (1 г сафранина + 100 мл дистиллированной воды + 40 мл глицерина), отмывают. Формазан-позитивные клетки отличаются большими размерами, они напоминают бластные клетки и содержат голубые гранулы. Обычно в препарате определяется около 30% формазан-позитивных клеток.
Вышеприведенные методы оценки фагоцитоза представляют собой обобщение очень большого числа публикаций. Более детальную информацию по этим вопросам можно найти в соответствующих работах.